李偉++++++鄭坤++++++曲巖++++++陳麗娟++++++王加志

[摘要] 目的 觀察阿魏酸對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡的影響。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將A375細(xì)胞分為五組：空白對(duì)照組，模型組，阿魏酸高、中、低濃度組?？瞻讓?duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，模型組和阿魏酸各濃度組培養(yǎng)基中加入過(guò)氧化氫，使其終濃度為0.1 mmol/L，處理4 h。采用熒光染料DAPI染色細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞凋亡情況，Caspase活性試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞Caspase活性。 結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，模型組Caspase-3、8、9活性水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。模型組細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)致密濃染的顆粒，松散淡染的新月體或環(huán)狀熒光，提示過(guò)氧化氫可誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。與模型組比較，阿魏酸高濃度組可顯著下調(diào)Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），但對(duì)Caspase-9作用不明顯。阿魏酸高劑量組細(xì)胞核呈均勻亮藍(lán)色，無(wú)致密凝集現(xiàn)象，阿魏酸低、中濃度組大多數(shù)細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)凝集和邊緣化。 結(jié)論 阿魏酸通過(guò)下調(diào)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的Caspase活性而起到保護(hù)黑素細(xì)胞凋亡作用。

[關(guān)鍵詞] 阿魏酸；Caspase；凋亡；A375細(xì)胞；氧化應(yīng)激

[中圖分類號(hào)] R758.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）11（b）-0011-03

[Abstract] Objective To observe the effect of ferulic acid on the apoptosis of melanocyte induced by oxidative stress. Methods According to random number table， A375 cells were divided into five groups： control group， model group， and high， middle， low concentrations of ferulic acid groups. Cells in the control group were cultured normally， while peroxide hydrogen was added into the cultured A375 cells of model group and high， middle， low concentrations of ferulic acid groups at the final concentration of 0.1 mmol/L， duration for 4 hours. The cells were stained with fluorescent dye DAPI. The apoptosis of each group was observed by fluorescence microscope. Caspase active kit was used to measure the activity of Caspase in each group. Results Compared with the control group， the activities of Caspase-3， 8 and 9 in the model group were significantly increased， with statistically significant differences （P < 0.01）. In the model group， dense and concentrated particles and the loose light colored crescent or annular fluorescence could be seen in the nucleus and cytoplasm， which implied that hydrogen peroxide can induce apoptosis of A375 cells. Compared with the model group， the expression of Caspase-3 and Caspase-8 were significantly reduced in the high does concentration of ferulic acid group， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）， but the effect on Caspase-9 was not obvious. The nucleus of cells in the high does concentration of ferulic acid group were even bright blue， without the phenomenon of dense condensation. There were chromatin agglutination and marginalization of most cell nucleus in the low and medium does concentrations of ferulic acid groups. Conclusion Ferulic acid can protect the apoptosis of melanocyte through lower the activity of Caspase induced by hydrogen peroxide.

[Key words] Ferulic acid； Caspase； Apoptosis； A375 cells； Oxidative stressendprint

皮膚黑素細(xì)胞凋亡是色素缺失性皮膚病發(fā)病的主要因素[1]，而凋亡的誘發(fā)因素中，氧化應(yīng)激損傷占重要地位[2]。在生理狀態(tài)下，L-酪氨酸經(jīng)過(guò)一系列氧化反應(yīng)最終形成黑色素，在這一過(guò)程中會(huì)同時(shí)引起表皮中過(guò)氧化氫的蓄積，而表皮黑素細(xì)胞在合成黑素小體的過(guò)程中也可導(dǎo)致胞漿內(nèi)活性氧（ROS）蓄積[3]，當(dāng)自由基的產(chǎn)生超出機(jī)體清除能力時(shí)，會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。黑素細(xì)胞受氧化攻擊后易發(fā)生凋亡[4]，黑素細(xì)胞凋亡又是色素缺失性皮膚病發(fā)病的重要原因，傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸對(duì)本病有較好的治療作用[5-6]，但其有效成分研究較少。阿魏酸（4-羥基-3-甲氧基肉桂酸）是桂皮酸的衍生物之一，也是當(dāng)歸的主要活性成分。研究顯示，阿魏酸對(duì)過(guò)氧化氫導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有很好的保護(hù)作用[7-8]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，觀察阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，為色素脫失性皮膚病治療和藥物研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品（0773-9910）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，人黑素瘤細(xì)胞（A375）購(gòu)于武漢細(xì)胞典藏中心；胎牛血清（NXB0568）、胰蛋白酶（SH30042.01B）、DMEM培養(yǎng)基（AC10220191）（HyClone公司）；二甲基亞砜（D5879）（Sigma公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（ST476）、細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗（C0222）、噻唑藍(lán)（MTT）（ST316）、Caspase3（C1115）、Caspase8（C1151）、Caspase9（C1157）活性檢測(cè)試劑盒、DAPI染色液（C1005）（碧云天生物技術(shù)研究所）；MK3型酶標(biāo)儀（熱電上海儀器有限公司），過(guò)氧化氫等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析醇。熒光顯微鏡（U-RFL-T，奧林巴斯）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與受試藥

A375細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液由DMEM培養(yǎng)基、FBS、雙抗按89∶10∶1比例配制。在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，經(jīng)胰蛋白酶消化，1000 r/min離心，棄上清用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分瓶培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度達(dá)約70%時(shí)，隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為空白對(duì)照組，模型組，阿魏酸低、中、高濃度組?？瞻讓?duì)照組常規(guī)培養(yǎng)、模型組和阿魏酸各濃度組均預(yù)先用含0.1 mmol/L過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基預(yù)處理相同時(shí)間。在前期工作中本課題組已摸索到阿魏酸在100 μmol/L濃度時(shí)增殖作用最強(qiáng)[9]，本研究以100、1、0.1 μmol/L 3個(gè)濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并命名為高濃度、中濃度和低濃度組。

1.3 凋亡形態(tài)學(xué)

調(diào)整細(xì)胞濃度約為2.0×104個(gè)/mL接種在24孔板中，每孔1 mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。藥物作用結(jié)束后棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，按說(shuō)明書操作，熒光顯微鏡測(cè)定。

1.4 Caspase-3、8、9活性測(cè)定

調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5×104個(gè)/mL接種在96孔板中，每孔200 μL，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組加培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，各實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，每孔200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按說(shuō)明書要求操作，酶標(biāo)儀405 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值。Caspase酶活性用OD405值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對(duì)A375細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

正常細(xì)胞的細(xì)胞核為暗藍(lán)色，顏色較深，在用含過(guò)氧化氫培養(yǎng)基作用1～2 h后，細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，過(guò)氧化氫作用4 h出現(xiàn)較明顯的凋亡形態(tài)改變，細(xì)胞核呈明亮鮮艷的藍(lán)色熒光，作用8 h細(xì)胞出現(xiàn)部分死亡，見(jiàn)圖1?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞核的熒光為彌散均勻的圓形或橢圓形；模型組細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)致密濃染的顆粒、新月體或環(huán)狀熒光，呈松散和淡染狀，提示過(guò)氧化氫可誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡；阿魏酸高劑量組細(xì)胞核呈均勻亮藍(lán)色，無(wú)致密凝集現(xiàn)象；阿魏酸低、中劑量組大多數(shù)細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)凝集和邊緣化。見(jiàn)圖2。

2.2 各組Caspase-3、8、9活性比較

與空白對(duì)照組相比，模型組Caspase-3、8、9活性顯著升高（P < 0.01），說(shuō)明氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)Caspase活性升高；與模型組相比，阿魏酸高濃度組對(duì)過(guò)氧化氫引起的Caspase-3、8酶活性升高有下調(diào)作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），下調(diào)后水平與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；而阿魏酸中、低濃度組的抑制作用不明顯。見(jiàn)表1。

3 討論

白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的色素脫失性皮膚病，發(fā)病率高，雖無(wú)明顯的自覺(jué)癥狀，由于皮損部位黑素保護(hù)功能缺失，在日光照射下可出現(xiàn)局部皮膚潮紅、瘙癢，嚴(yán)重者出現(xiàn)皮炎。白癜風(fēng)因皮膚上的皮損色差影響患者的容貌，造成患者精神上的巨大壓力，影響其工作、學(xué)習(xí)和生活。氧化應(yīng)激致色素細(xì)胞功能異常并導(dǎo)致皮膚黑素的代謝障礙，產(chǎn)生白癜風(fēng)等色素缺失性皮膚疾病[10-11]，嚴(yán)重者可累及毛發(fā)，造成灰發(fā)、白發(fā)等[12-13]。有研究證實(shí)，白癜風(fēng)患者表皮黑素細(xì)胞存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，并存在水平不斷增高的現(xiàn)象[14-17]。氧化應(yīng)激可通過(guò)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和死亡受體等細(xì)胞內(nèi)外途徑引起黑素細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)了白癜風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展[18]。本研究從黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷角度入手，以含0.1 mmol/L過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基作用于A375細(xì)胞，造模方法參考了田軍等[19]的研究結(jié)果，以細(xì)胞形態(tài)學(xué)和Caspase為觀察對(duì)象，探討阿魏酸對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡的影響。

細(xì)胞凋亡過(guò)程中伴隨著明顯的形態(tài)學(xué)改變，通過(guò)使用熒光染料染色可以通過(guò)形態(tài)學(xué)改變觀察細(xì)胞在凋亡中的進(jìn)程。DAPI是一種結(jié)合于DNA雙鏈的熒光染料，對(duì)凋亡過(guò)程中的DNA變化可以作出準(zhǔn)確反映。觀察含0.1 mmol/L過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基作用細(xì)胞1、2、4、8 h后DAPI染色，結(jié)果可見(jiàn)，作用1、2 h對(duì)細(xì)胞損傷作用不明顯，作用4 h開(kāi)始出現(xiàn)較明顯的變化，作用8 h后細(xì)胞死亡較多，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究以0.1 mmol/L過(guò)氧化氫作用4 h為處理?xiàng)l件。在用藥后，細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)是由Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其激活過(guò)程主要包括胞外死亡受體介導(dǎo)和線粒體依賴途徑，依次激活下游的Caspase，通過(guò)切割特異性底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡過(guò)程的不可逆。Caspase-8、9都是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵因子，參與該過(guò)程的程序化調(diào)控，這些因子受外源死亡受體途徑和內(nèi)源線粒體途徑的激活，Caspase-8、9是兩個(gè)途徑的共同部分。在應(yīng)激狀態(tài)下，酶原形式的Caspase-8、9活化并激活Caspase-3觸發(fā)細(xì)胞凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組細(xì)胞中Caspase-3、8、9的活性，結(jié)果顯示：模型組Caspase-3、8、9活性水平顯著高于空白對(duì)照組，提示過(guò)氧化氫所致的氧化應(yīng)激可激活A(yù)375細(xì)胞凋亡基因，阿魏酸高劑量組可顯著下調(diào)Caspase-3和Caspase-8的表達(dá)，從而抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的A375細(xì)胞凋亡，這可能是阿魏酸抗細(xì)胞凋亡作用機(jī)制的環(huán)節(jié)之一，中、低劑量組作用不明顯。endprint

綜上所述，阿魏酸通過(guò)下調(diào)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的Caspase活性而起到調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡作用。

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