楊 星，張美彥，張效平，商寶娣，李正友

( 貴州省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025 )

我國水產(chǎn)疫苗浸泡免疫研究現(xiàn)狀

楊 星，張美彥，張效平，商寶娣，李正友

( 貴州省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025 )

水產(chǎn)疫苗；浸泡免疫；現(xiàn)狀

中國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界首位，養(yǎng)殖集約化水平不斷提高，養(yǎng)殖水環(huán)境卻持續(xù)惡化，病害頻發(fā)[1]。目前，主要以抗生素等化學藥物防治水產(chǎn)動物的病害，長期使用不僅會增加病原菌的耐藥性，降低藥效，給魚病防治增加難度，同時也抑制了魚體內(nèi)部有益菌的生存，引起藥物在魚體內(nèi)富集，導(dǎo)致水產(chǎn)品質(zhì)量下降，對消費者存在潛在風險[2-3]。我國對魚類疾病的防控措施主要有藥物防控、免疫預(yù)防、生態(tài)與綜合防控等，目前在生產(chǎn)上使用的漁用疾病防治產(chǎn)品不多，特別是漁用疫苗的開發(fā)與應(yīng)用。與傳統(tǒng)的藥物防治相比，漁用疫苗不僅可以提高魚類特異性及非特異性免疫水平，增強免疫保護力，還具有無殘留、無污染、不易引起耐藥性等特點，因此，疫苗的免疫預(yù)防是控制水產(chǎn)動物病害較為有效的措施[4-5]。在漁用疫苗免疫操作中，浸泡免疫是最簡單的免疫方式，但在浸泡免疫操作中單純使用疫苗效果不佳，而且目前我國研究開發(fā)的新型疫苗抗原純度較高，特異性強，可免疫原性較差，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答較弱，而佐劑的應(yīng)用可提高其免疫原性，增強機體對抗原的免疫應(yīng)答，疫苗的浸泡只有選擇合適的佐劑配伍才能有效的提高浸泡免疫效果[6-7]。因此，隨著魚類養(yǎng)殖集約化程度越來越高，水產(chǎn)疫苗浸泡免疫的研究和應(yīng)用及浸泡用疫苗佐劑的開發(fā)就顯得更加迫切。本文僅對我國水產(chǎn)疫苗浸泡免疫研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 魚類黏膜免疫機制

魚類生活在病原微生物較為豐富的水環(huán)境中，其皮膚和鰓最先接觸病原微生物，這兩個部位的黏膜不僅為魚體提供物理屏障，其局部的特異和非特異性免疫還有殺滅入侵病原的作用[8]。研究水產(chǎn)疫苗浸泡免疫的關(guān)鍵是要弄清魚類皮膚黏膜和鰓黏膜的免疫機制，這對深入研究水產(chǎn)疫苗浸泡免疫機理和魚類病害防控具有重要意義。

1.1 魚類皮膚黏膜免疫機制

魚類擁有較為發(fā)達的非特異性免疫系統(tǒng)，其皮膚黏膜是抵御病原微生物入侵的第一道防線。當皮膚黏膜受到外界刺激后會產(chǎn)生大量黏液，這些黏液除具有物理隔離入侵的病原微生物作用外，其還含有許多抗菌物質(zhì)，可以有效地保護魚體免受感染[9]。因此，以魚類皮膚黏膜為基礎(chǔ)研究相關(guān)的免疫學，不僅對魚病的防治有重要的意義，還可為改善疫苗接種途徑，優(yōu)化疫苗制備工藝，提高疫苗免疫保護措施提供科學依據(jù)[10]。

魚體皮膚黏液中主要包含的抗菌物質(zhì)有抗菌肽、溶菌酶、蛋白酶、堿性磷酸酶和其他抗菌蛋白等，其中，溶菌酶可以有效破壞病原微生物細胞壁上的肽聚糖，是魚體抵御革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌侵襲的有效抗菌劑[11-13]。堿性磷酸酶是一種溶菌體酶，主要在魚體傷口愈合前期發(fā)揮保護性作用；黏液中的蛋白酶也可為魚體提供先天性免疫保護[14]。此外，魚體皮膚黏液中還包含很多重要的先天性免疫因子，如白介素、補體和干擾素等。它們分別在魚體抵御及殺滅入侵病原微生物過程中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用[15-17]。水產(chǎn)疫苗經(jīng)浸泡免疫后可使魚體皮膚黏膜系統(tǒng)產(chǎn)生大量的特異性抗體，表明魚體皮膚黏膜分泌的抗體具有保護機體和防御病原微生物感染的作用[18]。

1.2 魚類鰓黏膜免疫機制

魚類的鰓中含有許多淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞等，這些細胞具有產(chǎn)生免疫應(yīng)答的條件。胞內(nèi)酶活性檢測表明，粒細胞和巨噬細胞具有酸性和堿性磷酸酶活性。魚體鰓中許多細胞都可分泌趨化物質(zhì)，可將機體血液中的白細胞趨化至鰓組織內(nèi)，并長期滯留其中。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的鰓受到病原微生物刺激后，其嗜酸性粒細胞數(shù)量大量增加。Aaltonen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抗原先經(jīng)上皮細胞攝取后，再轉(zhuǎn)運至鰓部的吞噬細胞進行吞噬。已從魚類鰓中分離出的抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對革蘭氏陰性和陽性細菌均有作用[20]。經(jīng)疫苗浸泡免疫后，魚體鰓中抗體量增加，而血清中抗體量沒有變化，這說明魚類的鰓具備獨立進行局部免疫應(yīng)答的能力[21]。

2 水產(chǎn)疫苗免疫方式

我國研究和開發(fā)的漁用疫苗種類較多，但疫苗的推廣應(yīng)用主要取決于其免疫方式的研究和應(yīng)用程度。目前，漁用疫苗的免疫方式主要有注射、口服、浸泡和噴灑等，其中注射、口服和浸泡免疫在生產(chǎn)中應(yīng)用較多。

2.1 注射免疫

目前，國內(nèi)水產(chǎn)疫苗的免疫方式主要為注射免疫，魚體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答主要為系統(tǒng)免疫應(yīng)答，不僅可極顯著增加血清抗體量，還可以有效控制疫苗接種劑量，避免疫苗浪費，獲得的免疫保護效果較好[22-24]；根據(jù)接種部位，注射免疫一般分為肌肉注射、腹腔注射和皮下注射，其中腹腔注射免疫是疫苗接種最常用的方法，注射免疫能夠確?？乖M入受免魚體內(nèi)，適合用于進行相關(guān)免疫學研究的試驗魚免疫及集約化規(guī)模較小的養(yǎng)殖魚類的生產(chǎn)免疫。但其需將魚體從養(yǎng)殖水體中撈出，對受免魚體造成機械損傷和應(yīng)激性刺激，不適合在魚苗和魚類大規(guī)模養(yǎng)殖中推廣使用，在一定程度上限制了水產(chǎn)疫苗注射免疫的推廣應(yīng)用[25]。

2.2 浸泡免疫

浸泡免疫指將受免動物置于含有一定含量的疫苗溶液中浸泡一段時間，以達到免疫接種的目的，噴淋免疫是變化形式的浸泡免疫。目前，浸泡免疫接種的疫苗類型主要有滅活疫苗、DNA疫苗和亞單位疫苗等，其中全菌滅活疫苗的浸泡免疫對魚體的免疫效果較好。由于疫苗制備方法的差異或病原微生物的特殊性，導(dǎo)致其浸泡免疫效果參差不齊。如全菌滅活疫苗的浸泡免疫需在其中加入合適的佐劑才能發(fā)揮較好的免疫效果；亞單位疫苗的浸泡免疫需提取準確的免疫原才能發(fā)揮較理想的效果，且疫苗純度要求較高；由于DNA疫苗制備復(fù)雜，成本較高，浸泡免疫過程中使用較少[26-28]。浸泡免疫既可以誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)，也可以誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)免疫反應(yīng)，其免疫機理為：抗原可刺激皮膚和鰓黏膜組織產(chǎn)生特異性和非特異性免疫應(yīng)答，且抗原經(jīng)皮膚和鰓可進一步擴散至脾臟和外周血等系統(tǒng)免疫組織中，刺激機體產(chǎn)生系統(tǒng)免疫應(yīng)答[29-31]。浸泡免疫主要通過改變浸泡環(huán)境滲透壓等方法來提高魚體皮膚和鰓對疫苗的攝入量，其免疫效果受疫苗含量、水溫、受免魚體規(guī)格、浸泡時間長短和有無佐劑等的影響，其中，疫苗含量和浸泡時間對其影響最大[32-34]。目前，針對水產(chǎn)疫苗浸泡免疫效果不理想的情況，可配伍佐劑一起使用來提高魚類的浸泡免疫效果[35-37]。佐劑是一種能非特異性的增強機體對抗原的免疫應(yīng)答能力，而本身并無免疫原性，能夠發(fā)揮輔助作用的一類物質(zhì)。目前研究較多的用于浸泡免疫的佐劑主要有皂土、莨菪堿、甘草素、葡聚糖、雞蛋清和氯化鈉等，由于每種佐劑的性質(zhì)不同，在實際應(yīng)用中要根據(jù)疫苗種類和免疫環(huán)境等進行恰當選擇才能獲得較好的免疫效果[38-40]。在DNA疫苗浸泡魚體過程中，事先利用脂質(zhì)體包埋疫苗或是運用超聲波處理都能增強其免疫效果[41-42]。在實際應(yīng)用中，通常在疫苗溶液中加入食鹽或滲透劑等改變浸泡環(huán)境的滲透壓來增加受免魚體對疫苗的吸收量，增強免疫保護率[43-44]。

近年來，我國也開展了漁用疫苗浸泡免疫研究。羅霞等[29]研究發(fā)現(xiàn)，鱖魚(Sinipercachuatsi)浸泡免疫嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)全菌疫苗7 d后，皮膚黏液中抗體滴度達到峰值。王慶等[45]研究得出，斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)被哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)滅活疫苗浸泡免疫后，鰓和皮膚等組織中MHC-Ⅱ類分子表達量及黏液抗體滴度均有不同程度的上調(diào)。劉雨果等[46]研究發(fā)現(xiàn)，鱖魚經(jīng)嗜水氣單胞菌滅活疫苗浸泡免疫后，皮膚黏液和血清抗體水平都有不同程度的提高。張燕飛等[47]發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(Daniorerio)經(jīng)溶藻弧菌(V.alginolyticus)減毒活疫苗浸泡免疫后，免疫保護率達到66.7%。經(jīng)浸泡免疫后褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的黏液細胞數(shù)量顯著增加[48]。

綜上所述，雖然我國研究證實了疫苗浸泡免疫可以一定程度增強水產(chǎn)動物的免疫保護力，但影響疫苗浸泡免疫效果的因素較多，若不從各個方面優(yōu)化疫苗浸泡免疫程序，將嚴重阻礙我國水產(chǎn)疫苗浸泡免疫的推廣應(yīng)用。

2.3 口服免疫

口服疫苗主要是通過刺激魚體腸道黏膜系統(tǒng)來產(chǎn)生免疫應(yīng)答。雖然魚類缺乏哺乳動物那樣的相關(guān)腸道淋巴組織，但卻具有大量的淋巴細胞。當抗原進入魚體腸道后，小分子或可溶性物質(zhì)可經(jīng)細胞間隙進入血液，而大分子顆粒則經(jīng)巨噬細胞等呈遞給相關(guān)淋巴組織，引起機體相關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。研究表明，口服疫苗可以讓魚體獲得較好的免疫保護力[49]。但疫苗進入腸道后會被腸道相關(guān)消化酶等破壞，使免疫原性減弱，只有研究出一種有效的載體投遞系統(tǒng)，才能降低魚體胃腸道消化酶等對疫苗的影響[50]。

3種免疫方式效果的比較見表1。

表1 水產(chǎn)疫苗免疫方法的比較

3 面臨問題

魚類黏膜免疫系統(tǒng)自身存在一些缺陷及對浸泡免疫應(yīng)答機制尚不清楚，目前尚無一套科學的適合水產(chǎn)疫苗浸泡免疫的接種方法，現(xiàn)行的方法還存在許多薄弱環(huán)節(jié)，如疫苗被魚體攝入時抗原的性質(zhì)是可溶性抗原還是顆粒性抗原；浸泡用疫苗制備工藝的研究、免疫環(huán)境條件的優(yōu)化及免疫佐劑的選用等。同時，浸泡接種疫苗主要是通過皮膚和鰓等部位進行抗原的遞送，效果往往較差，導(dǎo)致免疫保護效果不理想[51]。

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，大部分養(yǎng)殖戶對疫苗浸泡免疫的流程了解較少，如浸泡工具的選用、浸泡時的水溫、溶解氧、食鹽用量的多少和滲透劑的選用等，若不能很好的掌握疫苗浸泡中的各個環(huán)節(jié)，就會導(dǎo)致魚種浸泡后死亡率較高，免疫效果較差。因此，根據(jù)魚種的大小和外界環(huán)境的變化等來確定合理的疫苗浸泡含量和浸泡時間等都是漁用疫苗浸泡免疫研究和推廣中亟待解決的問題。

4 發(fā)展趨勢

近些年來，隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展，相關(guān)魚類皮膚黏膜免疫學研究越來越受重視，魚類免疫基因的相關(guān)研究也取得了一定的進展，為深入研究魚類皮膚黏膜免疫系統(tǒng)提供了參考依據(jù)[45]。同時，開發(fā)研制新型無毒且效率高的免疫佐劑以增強疫苗浸泡免疫效力，將是疫苗浸泡免疫得到很好應(yīng)用的另一發(fā)展方向[52-53]。

水產(chǎn)疫苗浸泡免疫操作簡單，對魚體的刺激性也較小，且節(jié)省時間，可降低魚類生產(chǎn)成本，所以選用浸泡免疫是一種較實用的免疫方案。盡管目前疫苗的注射接種在魚類免疫中仍占主要位置，但實際操作勞動強度較大、容易造成魚體損傷甚至死亡等，因此，水產(chǎn)疫苗浸泡免疫方式的研究和推廣應(yīng)用是未來魚類免疫發(fā)展的方向。

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CurrentResearchStatusofVaccineImmersioninAquacultureinChina

YANG Xing， ZHANG Meiyan， ZHANG Xiaoping， SHANG Baodi， LI Zhengyou

( Fisheries Research Institute of Guizhou Academy of Aquaculture Sciences，Guiyang 550025，China )

vaccine in aquaculture；immersion；current status

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.026

2016-09-05；

2017-01-11.

國家自然科學基金地區(qū)科學基金資助項目(31560729)；國家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-46-49)；貴州省科技攻關(guān)項目(黔科合NY[2015]3003-1號)；貴州省特色水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(GZCYTX2013).

楊星(1987-)，男，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)動物病害防控.E-mail：xingy87@163.com.通訊作者：商寶娣(1987-)，女，副研究員；研究方向：水產(chǎn)動物病害防控.E-mail：shangbaodi1987@126.com.

S948

C

1003-1111(2017)05-0688-05