李永仁，梁 健，郭永軍

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)系，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384 )

細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)菲律賓蛤仔四倍體的初步研究

李永仁，梁 健，郭永軍

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)系，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384 )

采用不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞松弛素B抑制第一極體的釋放，誘導(dǎo)菲律賓蛤仔四倍體，觀察誘導(dǎo)各組胚胎的早期發(fā)育過程，結(jié)果表明，0.5、0.7 mg/L及1.0 mg/L的細(xì)胞松弛素B均能有效抑制第一極體的釋放，獲得四倍體誘導(dǎo)率分別為58.2%、55.1%及55.2%，無顯著差異；隨細(xì)胞松弛素B用量的升高，菲律賓蛤仔早期胚胎發(fā)育速度略有減慢，各發(fā)育階段胚胎畸形率顯著提高，畸形形式增加，孵化率降低。綜合分析，0.5 mg/L的細(xì)胞松弛素B適于誘導(dǎo)菲律賓蛤仔四倍體。

菲律賓蛤仔; 四倍體; 胚胎發(fā)育

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippenarum)俗稱花蛤、蜆子，屬雙殼類、簾蛤科、蛤仔屬，為廣溫、廣鹽性種類，是我國重要經(jīng)濟(jì)貝類，目前已成為世界性養(yǎng)殖貝類[1]。2014年蛤仔產(chǎn)量約占海水貝類產(chǎn)量的1/3，為我國單種養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的貝類，產(chǎn)業(yè)地位十分重要[2]。目前，蛤仔養(yǎng)殖業(yè)主要采用野生苗種，導(dǎo)致個體小型化、抗逆性差、繁殖季節(jié)死亡率高、單位產(chǎn)量降低[3]。

三倍體貝類因其不育性而具有生長速度快、成活率高、肉質(zhì)佳等優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀[4]，三倍體菲律賓蛤仔苗種的應(yīng)用，有望克服其在養(yǎng)殖中出現(xiàn)的問題[5]，利用四倍體與二倍體雜交，可培育全三倍體貝類[6]，是實現(xiàn)三倍體貝類產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

通過物理、化學(xué)以及生物等方法抑制第一極體釋放是誘導(dǎo)貝類四倍體的基本方法，其中，細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)法具有操作流程短、倍化率高的優(yōu)點，可有效制備貝類多倍體胚胎[5]。目前，已對長牡蠣(Crassostreagigas)、櫛孔扇貝(Chlamysferreri)、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、馬氏珠母貝(Pinctadamartenssi)、紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)等多種貝類開展四倍體育種相關(guān)研究[7-11]，但尚無對菲律賓蛤仔的四倍體誘導(dǎo)的系統(tǒng)研究。對菲律賓蛤仔三倍體胚胎發(fā)育的相關(guān)研究表明，三倍體的早期胚胎發(fā)育與普通二倍體差異顯著[5]，而對四倍體蛤仔早期胚胎發(fā)育的相關(guān)研究未見報道。

采用細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)法制備菲律賓蛤仔四倍體胚胎，觀察胚胎的早期發(fā)育過程，探討菲律賓蛤仔四倍體的適宜誘導(dǎo)條件，以期為海水雙殼類的多倍體育種提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 精卵

菲律賓蛤仔親貝來源于天津大神堂海域的野生群體，性腺自然成熟，于5月底采捕，清洗待用。親貝陰干4 h，置入經(jīng)紫外線照射2 h的砂濾海水，充氣，約12 min后開始排精產(chǎn)卵。迅速將開始排放配子的親貝撿出，淡水沖洗，單個置于盛有500 mL砂濾海水的燒杯中繼續(xù)排放配子。

分別鏡檢燒杯內(nèi)的排放物，選擇外形渾圓、大小均勻、未被精子污染的卵子合并，得到卵子約400萬粒，以100 μm孔徑的篩絹濾除組織碎屑，30 μm孔徑的篩絹收集，將卵子懸浮于4000 mL砂濾海水中；選擇游動迅速、分散度好的一份精液，以30 μm孔徑篩絹濾入燒杯待用。

1.2 授精

觀察精、卵密度，取約含2500萬枚精子的上層精液，加入卵子懸浮液，迅速攪動使受精均勻。受精卵懸浮液均分為4組，各1000 mL，為對照組和3個處理組。受精后13 min，向3個處理組分別加入細(xì)胞松弛素B(SIGMA)的二甲基亞礬溶液，迅速混勻，細(xì)胞松弛素B終質(zhì)量濃度分別為0.5、0.75、1.0 mg/L，受精后19 min，以30 μm孔徑的篩絹清洗受精卵。

1.3 胚胎發(fā)育及倍性測定

洗卵后，4組受精卵分別置入60 L砂濾海水內(nèi)進(jìn)行胚胎發(fā)育，初始密度20枚/mL，隔1 h攪動水體至胚胎浮游，微充氣，約21 h后發(fā)育至D形幼蟲。整個試驗過程，控制海水溫度24.8～25 ℃，鹽度25。

受精后，觀察各組受精卵的極體隨時間出現(xiàn)的比例，并分別于4細(xì)胞期、原腸期、擔(dān)輪期和D形期取樣，多聚甲醛固定，統(tǒng)計孵化率、各階段的畸形率及畸形形式。受精率設(shè)為卵裂胚胎數(shù)與總卵數(shù)的百分比；孵化率設(shè)為D形幼蟲數(shù)與受精卵的百分比。

D形幼蟲期，各組取樣，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚工作液固定，震蕩3 min，經(jīng)30 μm孔徑的篩絹過濾，得單細(xì)胞懸液，紫外流式細(xì)胞儀檢測，幼蟲的四倍體率為四倍體峰面積與總積分面積之比。

試驗重復(fù)3次平行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用單因素方差分析比較各組間4細(xì)胞期、原腸期、擔(dān)輪期以及D形期胚胎的畸形率、孵化率和誘導(dǎo)率。若差異顯著，用最小顯著性差異法比較組間均值差異。檢驗顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 早期胚胎發(fā)育進(jìn)程

受精過程中，統(tǒng)計對照組及處理組第一極體隨時間的釋放，細(xì)胞松弛素B的使用有效抑制了3個處理組的第一極體，隨細(xì)胞松弛素B使用質(zhì)量濃度的增加，第一極體抑制率提高(表1)；洗卵后，處理組第二極體迅速釋放，但釋放率低于同期對照組，其中，1.0 mg/L細(xì)胞松弛素B處理組的第二極體釋放比例顯著低于0.5 mg/L和0.75 mg/L細(xì)胞松弛素B處理組的第二極體釋放比例，說明高質(zhì)量濃度的細(xì)胞松弛素B對受精卵的發(fā)育產(chǎn)生了負(fù)面影響。

表1細(xì)胞松弛素B抑制第一極體的菲律賓蛤仔受精卵極體釋放的時間進(jìn)程 %

在2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞期，處理組胚胎發(fā)育進(jìn)程明顯慢于對照組；在各處理組，發(fā)育速度隨細(xì)胞松弛素B質(zhì)量濃度的增加而略減緩；各組于受精后21 h同時發(fā)育至D形幼蟲階段。處理組受精率低于對照組，且受精率隨細(xì)胞松弛素B質(zhì)量濃度的增加而降低(表2)。

表2 細(xì)胞松弛素B抑制第一極體的菲律賓蛤仔受精卵的胚胎發(fā)育進(jìn)程

注：表中時間為受精后50%胚胎達(dá)到相應(yīng)階段的時間.

2.2 致畸

細(xì)胞松弛素B的質(zhì)量濃度對4～8細(xì)胞期、原腸期、擔(dān)輪期及D形期胚胎的畸形率影響顯著(P<0.05)，在同一組，胚胎發(fā)育后期的畸形率基本高于前期，特別在擔(dān)輪期及初孵D形幼蟲階段，胚胎畸形率迅速升高(表3)。在相同發(fā)育階段，胚胎畸形率隨細(xì)胞松弛素B質(zhì)量濃度的增加而增加，其中，卵裂期與原腸期，0.5 mg/L與0.75 mg/L細(xì)胞松弛素B處理組之間的畸形率差異不顯著(表4)，但1 mg/L 細(xì)胞松弛素B處理組胚胎的畸形率迅速升高，D形幼蟲期的畸形率高達(dá)36%。

表3 細(xì)胞松弛素B抑制第一極體的菲律賓蛤仔受精卵各發(fā)育階段的畸形率 %

注：同一行內(nèi)，具有相同字母的數(shù)值差異不顯著(P>0.05).下同.

表4 細(xì)胞松弛素B抑制第一極體的菲律賓蛤仔受精卵各發(fā)育階段的主要畸形形式

2.3 四倍體誘發(fā)

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各處理組及對照組菲律賓蛤仔胚胎細(xì)胞的DNA含量(圖1)，結(jié)果表明，細(xì)胞松弛素B的使用顯著抑制第一極體的釋放，獲得了四倍體胚胎，細(xì)胞松弛素B質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg/L，四倍體誘導(dǎo)率為55.1%～58.2%(表5)，無顯著差異，其中，0.5 mg/L細(xì)胞松弛素B質(zhì)量濃度下四倍體誘導(dǎo)率最高。

圖1 對照組及細(xì)胞松弛素B處理組菲律賓蛤仔胚胎細(xì)胞的DNA含量分析a：對照組；b：細(xì)胞松弛素B處理組

3 討 論

3.1 四倍體誘導(dǎo)

細(xì)胞松弛素B是貝類多倍體的主要誘導(dǎo)劑之一，通過阻遏微絲的形成，抑制受精卵第一次成熟分裂縊縮環(huán)的形成，導(dǎo)致第一極體不能釋放，染色體加倍[12]。不同雙殼類的卵子，因其大小及卵子結(jié)構(gòu)的差異，對細(xì)胞松弛素B的敏感性不同，細(xì)胞松弛素B處理的適宜質(zhì)量濃度不同[5]。Scarpa等[10]采用1.0 mg/L的細(xì)胞松弛素B抑制第一極體釋放得到了17.4%的四倍體紫貽貝稚貝；常亞青等[11]采用0.4～1.0 mg/L的細(xì)胞松弛素B抑制第一極體誘發(fā)蝦夷扇貝四倍體，得到22%～56.5%的誘導(dǎo)率，其中，0.8 mg/L的細(xì)胞松弛素B質(zhì)量濃度下四倍體誘導(dǎo)率最高；王愛民等[9]以0.5～1.0 mg/L的細(xì)胞松弛素B抑制第一極體誘導(dǎo)四倍體馬氏珠母貝四倍體，在0.7 mg/L的細(xì)胞松弛素B質(zhì)量濃度下獲得最高誘導(dǎo)率。本研究中，采用了0.5、0.75、1.0 mg/L 3種細(xì)胞松弛素B質(zhì)量濃度，其誘導(dǎo)效果無顯著差異，在同一質(zhì)量濃度下，不同平行組之間的誘導(dǎo)率存在明顯差異，可能由于胚胎發(fā)育同步性的差異導(dǎo)致，而卵的成熟度與受精過程是決定胚胎發(fā)育同步性的主要因素[13]，因此，可通過對卵子的嚴(yán)格選擇以及受精過程的精確控制進(jìn)一步提高四倍體胚胎的誘導(dǎo)率。

3.2 細(xì)胞松弛素B的致畸效應(yīng)

目前，鮮見對雙殼類早期胚胎發(fā)育的系統(tǒng)研究，李永仁等[5]在高效誘導(dǎo)菲律賓蛤仔三倍體的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞松弛素B抑制第二極體的釋放，顯著提高了胚胎的畸形率，且畸形率與處理強(qiáng)度呈正相關(guān)。在本研究中，隨細(xì)胞松弛素B質(zhì)量濃度的升高，菲律賓蛤仔各發(fā)育階段的畸形率隨之升高，同時，孵化率迅速下降。在初孵D形幼蟲階段，0.5 mg/L與0.75 mg/L細(xì)胞松弛素B處理組胚胎的畸形率比對照組平穩(wěn)提高，而1 mg/L細(xì)胞松弛素B處理組胚胎的畸形率則大幅度提高，不適于菲律賓蛤仔四倍體誘導(dǎo)。對原腸期、擔(dān)輪期和D形期胚胎的畸形形式進(jìn)行統(tǒng)計，對照組主要有4種畸形形式，0.5～0.75 mg/L細(xì)胞松弛素B處理組胚胎包括6～7種畸形形式，而1 mg/L細(xì)胞松弛素B處理組胚胎涵蓋全部10種畸形形式，其中包括分裂球破裂、胚胎解體等極端畸形形式。細(xì)胞松弛素B對胚胎的影響可能有兩方面原因：細(xì)胞松弛素B本身具有毒性，受精卵內(nèi)殘留的細(xì)胞松弛素B影響微絲合成，從而影響正常的細(xì)胞的分裂過程，導(dǎo)致胚胎畸形；另一方面，第一極體的抑制，導(dǎo)致第二次成熟分裂異常，出現(xiàn)多種染色體分離形式，造成大量的非整倍體胚胎[12]，而非整倍體胚胎難以正常發(fā)育。

發(fā)育進(jìn)度方面，細(xì)胞松弛素B有效抑制了第一極體的釋放，且處理組第二極體的釋放率低于對照組，在4～8細(xì)胞期，處理組的發(fā)育速度較對照組慢1～2 min。Argyriou-Tirita等[14]認(rèn)為，四倍體胚胎的DNA含量較普通二倍體胚胎高一倍，細(xì)胞分裂時，DNA復(fù)制量顯著增加，紡錘體等有絲分裂器的負(fù)載增加，導(dǎo)致細(xì)胞分裂異?；蚍至阉俣染徛?/p>

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TetraploidInductioninManilaClamRuditapesphilippenarumwithCytochalasinB

LI Yongren， LIANG Jian， GUO Yongjun

( Tianjin Key Laboratory of Aqua-ecology and Aquaculture, Department of Fishery Sciences, Tianjin Agricultural College, Tianjin 300384, China )

An effective chemical treatment, cytochalasin B (CB), was selected to induce tetraploid in fertilized eggs and to observe early embryonic development of Manila clamRuditapesphilippinarumat polar body I (PB1). The results showed that PB1 was inhibited effectively by CB at concentration of 0.5 mg/L，0.7 mg/L and 1.0 mg/L with induction rate as high as 58.2%,55.1% and 55.2%, respectively. In addition, there was no significant difference in the induction rate each other. With the increase in CB concentration, the development of early embryos was slightly slower, the malformation rate and abnormal form were significantly increased, and the hatching rate decreased significantly. As a result, the findings suggested that 0.5 mg/L of CB was the optimal concentration for tetraploid induction of Manila clam.

manila clamRuditapesphilippenarum; tetraploid; embryonic development

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.05.022

2016-07-20；

2016-12-25.

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(15JCYBJC30400)；天津市科技特派員項目(16JCTPJC46200)；天津市現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系—水產(chǎn)—貝類養(yǎng)殖崗位項目(ITTFRS2017013)；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目(201602050).

李永仁(1978-)，男，副教授；研究方向：海洋生物學(xué). E-mail：lyr1018@163.com.

S968.317

A

1003-1111(2017)05-0666-04