楊春文，金建麗，劉艷爽，金志民，劉鑄

(牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

鼠類標(biāo)本中DNA提取方法的優(yōu)化及PCR檢測

楊春文，金建麗，劉艷爽，金志民，劉鑄

(牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

為探討鼠類標(biāo)本DNA提取方法，提取鮮樣、鹽漬、干制等不同處理方式保存的棕背鼠平Myodesrufocanus樣本DNA，通過對mtDNA控制區(qū)序列PCR檢測，經(jīng)序列測定和比對分析，證明提取的DNA為目的鼠類DNA，試驗(yàn)方法可行。不同方法保存的鼠樣本可作為科學(xué)研究資源。

方法；鼠類標(biāo)本；DNA；提取方法；優(yōu)化；PCR

鼠類是生物中的重要類群之一，與人類的生產(chǎn)生活密切相關(guān)。隨著科學(xué)研究的不斷進(jìn)步，與鼠類相關(guān)的研究領(lǐng)域和技術(shù)不斷擴(kuò)展。已有研究表明，鼠類攜帶病原體200余種，其中可使人類致病的病原體達(dá)56種?？诎缎l(wèi)生檢疫為防控疾病傳播與流行，在對輸入性鼠類的鑒定檢測中，常遇到風(fēng)干或腐敗的標(biāo)本，從而加大了標(biāo)本檢測的難度[1]；在防范外來有害生物入侵和傳播途徑工作中，鑒定和甄別不明鼠尸、不完整鼠體時(shí)，DNA提取方法可提供技術(shù)支撐；在鼠類資源調(diào)查和普查工作中，鑒定普查標(biāo)本的種類也可以借助各種館藏標(biāo)本進(jìn)行比對和DNA鑒定手段。在鼠類分類及遺傳多樣性研究中，經(jīng)常選用歷史上保留下來的標(biāo)本。因此，探索鼠類標(biāo)本的DNA提取方法在上述研究領(lǐng)域具有重要作用。關(guān)于動物DNA提取方法的研究已有許多報(bào)道[2-8]，作者對鼠類干制標(biāo)本和鹽漬標(biāo)本的DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化，為今后利用館藏鼠類標(biāo)本及開展鼠類的分子生物學(xué)研究提供方法和基本資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 選用野外捕獲的棕背鼠平活鼠,牡丹江師范學(xué)院標(biāo)本館藏的無霉變、無蟲蛀干制棕背鼠平標(biāo)本，鹽漬2個(gè)月以上的棕背鼠平標(biāo)本(表1)，并確保樣品無其他DNA污染。

表1 棕背鼠平標(biāo)本來源

1.2 基因組DNA提取方法

1.2.1 鹽漬標(biāo)本DNA提取

1.2.1.1 除鹽 取適量樣本于1.5 mL的Eppendorf管中，剪成碎塊，加入1 mL的無菌水，振蕩后靜置5～10 min，之后將水傾出，并輕輕擠壓多余水分，重復(fù)浸泡擠壓5次以上。

1.2.1.2 樣品消化 加入消化液：450 μL TNE+45 μL SDS+pr K(2 mg/mL) 5 μL，55 ℃水浴鍋中消化一夜。

1.2.1.3 DNA提取 在消化液中加入500 μL 飽和酚，混勻10 min；5 500 rpm/min，4 ℃，離心10 min；取上清液，加入500 μL飽和酚，重復(fù)提取1次；上清液中加入500 μL氯仿，5 500 rpm/min，4 ℃，離心10 min，取上清液，重復(fù)提取1次。然后將上清液加入5 μL 10 mg/mL的RNase，37 ℃恒溫水浴30 min，加1 000 μL冷凍的無水乙醇，輕混，放入-70 ℃超低溫冰箱2 h后取出，13 000 rpm/min，4 ℃，離心15 min。棄去乙醇，加入適量的TE，待DNA溶解后，混勻，放入4 ℃冰箱保存。

1.2.2 干制標(biāo)本DNA提取 干制標(biāo)本的預(yù)處理參照文獻(xiàn)[7]并作適當(dāng)改進(jìn)。剪標(biāo)本皮膚約0.4 cm2(約0.1 g)，剪碎至1 mm2以下，置于Eppendorf管中，加入500 μL無水乙醇，振蕩后靜置30 min，4 500 rpm /min離心6 min，去上清液；無菌水振蕩，4 500 rpm /min離心6 min，去上清；重復(fù)3次以上。加入500 μL浸泡液(10 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，pH 8.0)，室溫放置最好5～6 h，4 500 rpm /min離心6 min，傾去上清液。加入500 μL去離子水，振蕩，6 000 rpm/min離心6 min，傾去上清，快速重復(fù)2次。

經(jīng)以上方法處理好的樣本按1.2.1.3鹽漬樣品DNA提取方法提取DNA。

1.2.3 新鮮標(biāo)本DNA提取 按1.2.1.3鹽漬樣品DNA提取方法提取新鮮標(biāo)本DNA。

1.2.4 mtDNA-PCR擴(kuò)增反應(yīng) 對提取的棕背鼠平樣本的mtDNA控制區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。反應(yīng)體系:10 μL，含200 μmol/L的dNTP，1.5 mmol/L的MgCl2，引物各2 pmol，Taq DNA聚合酶0.5 U，模板DNA 100 ng。所用引物為上海生物工程有限公司合成，rTaq購于大連寶生物公司。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 對提取的棕背鼠平標(biāo)本mtDNA控制區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓90 V，40 min，Goldview染色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察(圖1)。

注：a.棕背鼠平新鮮標(biāo)本； b.棕背鼠平鹽漬標(biāo)本； c.棕背鼠平干制標(biāo)本；Marker：DL-2000；a-c中的數(shù)字1～7均為鼠標(biāo)本號圖1 提取的DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 棕背鼠平線粒體控制區(qū)目標(biāo)序列比對 PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測序,獲得長度大于800bp的DNA序列，并與GenBank中棕背鼠平序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，所得產(chǎn)物量和純度均符合研究需要。

表1 棕背鼠平線粒體控制區(qū)目標(biāo)序列比對

注：1.GenBank已知棕背鼠平線粒體控制區(qū)目標(biāo)DNA序列； 2.干制標(biāo)本DNA序列； 3.鹽漬標(biāo)本DNA序列； 4.新鮮標(biāo)本DNA序列。

3 結(jié)論和討論

細(xì)胞內(nèi)DNA 含量隨死亡時(shí)間延長而呈下降趨勢[10]，對于陳舊標(biāo)本，由于保存條件不當(dāng)，長期受到物理、化學(xué)、生物降解等方面的作用，加大了DNA的提取難度。Carsten M指出：由于非新鮮標(biāo)本中DNA大多斷裂為較小片段，所以一般擴(kuò)增的DNA片段不應(yīng)太長，擴(kuò)增的目標(biāo)片段以低于500bp為宜[11]。本研究在鼠類標(biāo)本DNA提取方法上參考了相關(guān)的研究報(bào)道，并針對不同保存方法的鼠類樣本進(jìn)行相應(yīng)處理：鹽漬樣本重點(diǎn)放在DNA提取前的除鹽過程，根據(jù)鹽漬時(shí)間和相應(yīng)的NaCl用量適當(dāng)增加用水浸泡的時(shí)間和除鹽次數(shù)，避免過多NaCl干擾DNA提取結(jié)果；干制標(biāo)本的預(yù)處理過程重點(diǎn)放在標(biāo)本的軟化階段，預(yù)處理用無水乙醇浸泡，去除皮膚表層殘留的脂溶性成分，并達(dá)到對標(biāo)本的清洗及消毒作用，以避免脂肪的殘留影響標(biāo)本與浸泡液和消化液的充分接觸而造成消化不完全，從而降低DNA的提取量，浸泡液對標(biāo)本的浸泡時(shí)間最好5～6 h，之后，用高濃度Na鹽浸泡液浸泡，軟化組織，減少消化時(shí)間，高濃度金屬離子并可抑制DNA的降解。無水乙醇浸泡和浸泡液浸泡兩個(gè)步驟，減少基因組DNA提取過程中可能造成的機(jī)械斷裂[12]是方法的關(guān)鍵。

分別采用不同的處理方法，提取新鮮、鹽漬、干制等不同處理方式保存的鼠類樣本DNA，設(shè)置空白對照以及陽性對照，對提取的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后對線粒體控制區(qū)目標(biāo)序列(可用于分析比對序列長度800 bp)進(jìn)行比對分析，并將擴(kuò)增出的線粒體控制區(qū)目標(biāo)序列與Genbank中的數(shù)據(jù)相比對，證明了所提取DNA的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，選用適當(dāng)方法，從不同處理方法保存的鼠類標(biāo)本中提取的DNA，完全能夠滿足分子生物學(xué)研究的需要。

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PCRdetectionandoptimizationofDNAextractioninrodentspecimens/

YANG Chunwen,et al.

(Mudanjiang Normal University,Mudanjiang 157011,China)

In order to study the DNA extraction method,the DNA samples were extracted from fresh,salted,dried specimens ofMyodesrufocanus.By PCR detection and analysis of mtDNA control region sequence,the results showed that DNA extractives were the DNA of target rodent and the test method was feasible.The rodent specimens with different preservation methods can be used as resources for scientific research.

method;rodent specimen;DNA;extraction method;optimization;PCR

2016-11-14；

2016-12-09

黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目“森林嚙齒動物種群崩潰機(jī)理及控制技術(shù)研究”；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目(12541833)

楊春文(1958— )，男，黑龍江蘭西人，教授，主要研究方向動物生態(tài)學(xué)。

S764.5

A

1671-0886(2017)03-0019-03

(責(zé)任編輯 李海燕)