孫亮亮，劉陽(yáng)陽(yáng)，張?zhí)O，王如玲，馬金虎，徐進(jìn)*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.中國(guó)科學(xué)院 西雙版納熱帶植物園，云南 勐臘 666303)

一氧化氮參與調(diào)控鑭誘導(dǎo)的擬南芥主根生長(zhǎng)的生理與分子機(jī)理

孫亮亮1,2，劉陽(yáng)陽(yáng)2，張?zhí)O2，王如玲2，馬金虎1*，徐進(jìn)2*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.中國(guó)科學(xué)院 西雙版納熱帶植物園，云南 勐臘 666303)

[目的]鑭 (La)是一種稀土元素，La誘導(dǎo)了根尖ROS的累積，從而抑制了主根 (PR)生長(zhǎng)。本研究旨在探明NO是否也參與調(diào)控了La誘導(dǎo)的根系結(jié)構(gòu)重排 (RSA)。[方法]采用植物生理學(xué)和遺傳學(xué)等研究方法，分析了La誘導(dǎo)的根尖NO累積及其生理學(xué)影響。[結(jié)果]研究表明，抑制NO的累積顯著緩解了La對(duì)根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂勢(shì)的抑制，因而緩解了La誘導(dǎo)的PR生長(zhǎng)抑制；進(jìn)一步的遺傳學(xué)分析中，我們使用NO缺陷突變體noa1證實(shí)了NO參與調(diào)控了La誘導(dǎo)的PR生長(zhǎng)。抑制根尖NO的累積并不影響ROS的水平；同樣抑制ROS的累積也不影響NO的水平。[結(jié)論]結(jié)果表明，La誘導(dǎo)的根尖NO和ROS的累積是通過(guò)相互獨(dú)立的途徑參與調(diào)節(jié)PR生長(zhǎng)，因而導(dǎo)致了RSA。

鑭； 一氧化氮； 活性氧； 主根生長(zhǎng)； 擬南芥

作為一種作物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，稀土元素鑭 (La)已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用近50年[1～3]。La影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境耐受等諸多過(guò)程。大量生理學(xué)研究表明，La參與調(diào)節(jié)了植物體內(nèi)抗氧化酶活性、光合作用效率、礦質(zhì)元素的吸收和運(yùn)輸，以及激素平衡等許多方面[4,5]。低濃度的La促進(jìn)了植物生長(zhǎng)，高濃度La則顯著抑制了作物生長(zhǎng)發(fā)育[5]。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度La抑制了主根 (PR)生長(zhǎng)的同時(shí)，顯著誘導(dǎo)側(cè)根 (LR)發(fā)生，因而調(diào)節(jié)了植物的根系結(jié)構(gòu)[3]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，La誘導(dǎo)的根尖活性氧 (ROS)參與調(diào)控了這一過(guò)程，但其中詳細(xì)的分子機(jī)理尚不完全清楚。

一氧化氮(NO)是一種小分子、無(wú)色無(wú)味的氣體。大量研究表明，NO參與調(diào)控了植物和動(dòng)物體的各項(xiàng)生理活動(dòng)。在動(dòng)物體中，NO合成酶NOS催化合成NO。在高等植物體內(nèi)，研究者確實(shí)探測(cè)到了NOS活性，但是，植物NOS卻一直沒(méi)有鑒定出來(lái)[6]。使用外源NO處理，顯著抑制了植物PR生長(zhǎng)，但卻誘導(dǎo)了LR發(fā)生[7]。然而，NO缺失突變體noa1的PR生長(zhǎng)卻顯著低于野生型對(duì)照。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，noa1突變體中的ROS含量顯著高于野生型，因而導(dǎo)致了植物體內(nèi)的氧化傷害和PR生長(zhǎng)抑制的表型。這表明NO參與調(diào)控了植物體內(nèi)ROS含量的動(dòng)態(tài)平衡和根尖干細(xì)胞龕的活性，因而調(diào)節(jié)了PR生長(zhǎng)[8]。NO參與調(diào)控了生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的LR發(fā)育[9]、不定根生長(zhǎng)，以及根毛的發(fā)育過(guò)程[10]。NO在植物響應(yīng)重金屬毒害中的生理機(jī)理研究已有廣泛報(bào)導(dǎo)[7,11～13]。然而，目前我們還不清楚NO是否還參與調(diào)節(jié)了稀土元素La誘導(dǎo)的根系構(gòu)型變化過(guò)程。在本研究中，分析了La誘導(dǎo)的根尖NO水平，以及其對(duì)PR生長(zhǎng)的生理作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料與藥物處理

擬南芥野生型和突變體種子分別經(jīng)50%花王消毒水進(jìn)行表面消毒處理5 min后，用滅菌水清洗5次，播種至1/2 MS培養(yǎng)基 (1%，10%蔗糖，pH 5.75)中。置于4 ℃冰箱中黑暗春化處理2 d后，取出置于溫室垂直培養(yǎng) (22 ℃, 16 h/8 h光周期)。藥物處理包括：150 μmol·L-1La(NO3)3(Sangon, China)，500 μmol·L-1L-NAME (Beyotime, China)，1 mM KI (Sangon, China)。每個(gè)處理至少取20株幼苗進(jìn)行分析，每實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2 GUS染色

帶有GUS報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因株系，在進(jìn)行藥物處理結(jié)束后，將幼苗取出置于GUS染液中[3]，在37 ℃水浴鍋中溫浴染色3～5 h后，進(jìn)行顯微觀察并拍照。

1.3 NO和ROS熒光探針標(biāo)記和顯微觀察

使用NO特異熒光探針DAF-2 DA和ROS特異熒光探針植物根尖DCFH-DA (Beyotime, China)進(jìn)行根尖NO和ROS含量分析。染色方法具體參考說(shuō)明書。染色結(jié)束后，將根取出用磷酸緩沖液PBS沖洗2～3遍后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察 (Zeiss, NO: 激發(fā)波長(zhǎng) 495 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 515 nm；ROS: 激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 La誘導(dǎo)根尖NO的累積參與調(diào)控PR生長(zhǎng)

研究發(fā)現(xiàn)，La誘導(dǎo)了根尖ROS的累積[3]。已有研究表明，NO在植物根系響應(yīng)重金屬等非生物逆境脅迫中具有重要作用[7]。因此，我們分析了La處理下，根尖NO的水平。NO探針DAF-2 DA染色結(jié)果表明，La處理明顯誘導(dǎo)了根尖NO的累積。La處理6 h后，NO含量明顯升高，并一直維持較高的水平 (圖1A)。

圖1 NO參與了La誘導(dǎo)的PR生長(zhǎng)抑制. A. 5 d齡擬南芥幼苗經(jīng)150 μmol·L-1 La(NO3)3處理3 h～2 d. NO熒光探針DAF-2 DA染色結(jié)果。B. 500 μmol·L-1 L-NAME 處理3 d后PR生長(zhǎng). C. 500 μM L-NAME 處理3 d后相對(duì)PR生長(zhǎng).Fig.1 Involvement of NO in the La-mediated inhibition of primary root growth. A. Detection of NO production in the roots of 5-day-old wild-type seedlings exposed to 150 μM La(NO3)3 for periods of up to 2 d using the NO-specific fluorescence probe DAF-2 DA. B. Primary root length of col-0 seedlings treated with or without 150 μM La(NO3)3 in the presence or absence of 500 μM L-NAME for 3 d. C. The relative root length of col-0 seedlings treated with or without 150 μM La(NO3)3 in the presence or absence of 500 μM L-NAME for 3 d.

分析了La誘導(dǎo)的NO累積在PR生長(zhǎng)中的生理作用。使用NOS抑制劑L-NAME處理后，La誘導(dǎo)的PR生長(zhǎng)抑制作用得到顯著緩解 (圖1B)。為了進(jìn)一步確認(rèn)該藥理學(xué)分析的結(jié)果，使用NO缺陷突變體noa1進(jìn)行了遺傳學(xué)驗(yàn)證。如圖1C所示，在noa1突變體中，La誘導(dǎo)的PR生長(zhǎng)抑制作用顯著低于野生型對(duì)照。這些結(jié)果表明，La誘導(dǎo)的NO累積參與調(diào)控了PR生長(zhǎng)。

2.2 La誘導(dǎo)的根尖NO和ROS累積是兩條相互獨(dú)立的途徑

NO與ROS協(xié)同作用調(diào)控根系發(fā)育已有報(bào)導(dǎo)[7]。因此，我們進(jìn)一步分析了La誘導(dǎo)的NO和ROS累積的上下游關(guān)系。使用外源NOS抑制劑L-NAME處理后，根尖ROS水平未受影響 (圖2A)，同樣，使用ROS清除劑KI處理后，根尖NO水平也未受影響 (圖2B)。遺傳學(xué)分析結(jié)果表明，La處理后，與野生型相比，NO缺陷的noa1突變體中ROS水平并無(wú)明顯差異 (圖3A)；同樣，La處理下的ROS缺陷的rbohC、rbohD、rbohF突變體中NO的水平也與野生型無(wú)明顯差異 (圖3B)。這些結(jié)果表明，La誘導(dǎo)的根尖NO和ROS的累積是通過(guò)兩條相互獨(dú)立的途徑。

圖2 根尖ROS和NO含量分析. 注：A. ROS熒光探針檢測(cè). B. NO熒光探針檢測(cè).Fig.2 Root of Ros and No content andysis. Note: Detection of ROS (A) and NO (B) production in the roots of 5-day-old wild-type seedlings exposed to 150 μM La(NO3)3 in the presence or absence of 500 μM L-NAME or 1 mM KI for 12 h using the ROS-specific fluorescent probe DCFH-DA and the NO-specific fluorescence probe DAF-2 DA.

2.3 外源NOS抑制劑處理緩解了La對(duì)根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂勢(shì)的抑制作用

研究發(fā)現(xiàn)，La抑制了根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂勢(shì)，因而抑制了PR生長(zhǎng)[3]。因此使用了一個(gè)用于檢測(cè)細(xì)胞周期的proCYCB1、1:CYCB1、1-GUS轉(zhuǎn)基因株系，分析了La誘導(dǎo)的NO累積對(duì)根尖分生區(qū)細(xì)胞分裂勢(shì)的影響。La處理抑制了根尖CYCB1;1-GUS活性，補(bǔ)充以外源NOS抑制劑L-NAME，增加了根尖GUS活性 (圖4)。這些結(jié)果表明，La誘導(dǎo)的NO累積通過(guò)對(duì)分生區(qū)細(xì)胞的影響，參與調(diào)控了PR生長(zhǎng)。

圖4 proCYCB1;1:CYCB1;1-GUS幼苗經(jīng)150 μM La(NO3)3處理后根尖GUS 染色分析.Fig.4 GUS staining of proCYCB1;1:CYCB1;1-GUS roots exposed to 150 μM La(NO3)3 in the presence.

3 結(jié)論與討論

植物NO和ROS的累積， 以及它們的相互作用調(diào)控根系生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理已有報(bào)導(dǎo)[14,15]。La誘導(dǎo)了根系ROS的累積，因而影響了細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)[16,17]。La誘導(dǎo)了根尖ROS的累積，影響了根尖生長(zhǎng)素的累積和分布，最終抑制了PR生 長(zhǎng)[3]。在本研究中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，La誘導(dǎo)的根系NO累積參與調(diào)控了根系構(gòu)型的改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，La不能誘導(dǎo)noa1突變體中NO的累積，表明La誘導(dǎo)的NO累積是通過(guò)NOA1途徑。遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，noa1 突變體的PR生長(zhǎng)表現(xiàn)出對(duì)La的不敏感表型；而且，藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用L-NAME抑制NO的累積，減輕了La對(duì)分生區(qū)細(xì)胞分裂的抑制作用。這些結(jié)果表明，升高的NO水平，通過(guò)對(duì)分生區(qū)細(xì)胞分裂的抑制，從而抑制了PR生長(zhǎng)。NO可通過(guò)多種途徑調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)。在動(dòng)物細(xì)胞中，NO通過(guò)氧化應(yīng)激、損傷DNA、破壞Ca2+平衡等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 (PCD)[18]。Cd毒害誘導(dǎo)的NO累積導(dǎo)致煙草BY2細(xì)胞出現(xiàn)PCD，但其中詳細(xì)的分子機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，在Zn毒害和病原菌誘導(dǎo)的植物細(xì)胞PCD中，是NO與ROS協(xié)同作用的結(jié)果[7,19]。NO和ROS的協(xié)同作用調(diào)控了植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)的過(guò)程[7,18]。在擬南芥懸浮細(xì)胞系中，鎘 (Cd)誘導(dǎo)的NO累積促進(jìn)了ROS的累積[19]。鋅 (Zn)毒害誘導(dǎo)了NO的累積促進(jìn)了H2O2的累積，因而調(diào)節(jié)了根系構(gòu)型[7]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，La誘導(dǎo)了根系NO和ROS的累積；抑制NO的累積并未影響La誘導(dǎo)的ROS水平，同時(shí)抑制ROS的累積也并未影響La誘導(dǎo)的NO的水平，遺傳學(xué)分析也支持了這個(gè)結(jié)果。這些結(jié)果表明，NO和ROS參與調(diào)控了La誘導(dǎo)的根系發(fā)育可能通過(guò)兩個(gè)相互獨(dú)立的過(guò)程。

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PhysiologicalandmolecularmechanismsofnitricoxideinLanthanum-modulatedprimaryrootgrowthinArabidopsis

SunLiangliang1,2,LiuYangyang2,ZhangPing2,WangRuling2,MaJinhu1*,XuJin2*

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.KeyLaboratoryofTropicalPlantResourcesandSustainableUse,XishuangbannaTropicalBotanicalGarden,ChineseAcademyofSciences,Mengla666303,China)

[Objective]Lanthanum (La) is one of rare earth elements that La represses primary root (PR) elongation by inducing ROS accumulation in root tips. The aim of the present study was to elucidate whether and how NO was also involved in La-mediated root system architecture remodeling (RSA) remain unclear.[Methods]For this purpose, we analyzed La-induced NO accumulation and its roles in modulating PR growth by integrating physiological studies and genetic analyses.[Results]Ourresult indicated that inhibition of NO accumulation alleviated the inhibitory effects of La on PR elongation. Genetics analysis using NO-defective mutantnoa1 supported theresult . Inhibition of NO production did not affect the ROS levels, and inhibition of ROS production did not affect the NO levels.[Conclusion]The result indicated that NO and ROS signaling pathways function to modulate RSA through mutually independent pathways.

Lanthanum, Nitric oxide, Reactive oxygen species, Primary root growth,Arabidopsis

S143.7+2

A

1671-8151(2017)12-0849-05

2017-07-24

2017-08-20

孫亮亮(1989-)，男(漢)，河南周口人，碩士研究生，研究方向：種子逆境生理

*通信作者：馬金虎，教授，Tel：0871-65140420；E-mail: mjh109@126.com；徐進(jìn)，教授，Tel：0871-65140420；E-mail: xujin@xtbg.ac.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (31272239)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 (2016YFC0501901)；云南省中青年學(xué)術(shù)帶頭人后備人才項(xiàng)目(2014HB043)

(編輯：張莉)