馮章麗，劉暢，顧廣軍，程顯敏，劉延杰，卜海東，于文全

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157041)

SSR分子標(biāo)記在梨遺傳育種研究中的應(yīng)用

馮章麗，劉暢，顧廣軍，程顯敏，劉延杰，卜海東，于文全*

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157041)

對(duì)SSR分子標(biāo)記在梨的品種鑒定，種質(zhì)資源評(píng)價(jià)，重要農(nóng)藝性狀的基因定位以及分子標(biāo)記輔助選擇育種等4個(gè)方面的研究應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)當(dāng)前SSR標(biāo)記在梨研究中存在的主要問(wèn)題和應(yīng)用前景進(jìn)行了分析，旨在為開(kāi)展梨分子遺傳育種提供參考。

SSR；梨；遺傳育種；應(yīng)用

梨屬于薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomoideae)梨屬 (Pyrus) 多年生果樹(shù)。我國(guó)梨屬于東方梨(Oriental pears or Asian pears)種群，包含有13個(gè)種，是世界梨屬植物最主要的起源地之一，有著豐富的梨屬資源[1-2]。為了更好的利用和評(píng)價(jià)梨屬資源，多年來(lái)研究者們采用形態(tài)學(xué)，細(xì)胞學(xué)和同工酶標(biāo)記等方法對(duì)我國(guó)梨屬植物在分類(lèi)學(xué)，親緣關(guān)系以及品種選育研究等方面進(jìn)行了研究，并取得了階段性的進(jìn)展。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，利用分子標(biāo)記技術(shù)為梨屬植物的系統(tǒng)關(guān)系和品種親緣關(guān)系的研究提供了新的手段。至今為止，前人已經(jīng)利用了SSR[3-7]，ISSR[8-9]，RFLP[10]，RAPD[11]，SRAP[12]以及AFLP[4,13]等分子標(biāo)記對(duì)梨資源開(kāi)展了相關(guān)研究。SSR標(biāo)記作為最常用的分子標(biāo)記之一，由于其具有數(shù)量多，共顯性，重復(fù)性好以及易操作等優(yōu)點(diǎn)受到眾多研究者的青睞。目前，SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用在梨資源的品種資源鑒定，遺傳基礎(chǔ)評(píng)價(jià)，重要農(nóng)藝性狀的基因定位以及分子輔助育種等多個(gè)方面，但由于SSR標(biāo)記技術(shù)在梨屬資源中的研究應(yīng)用起步較晚，相關(guān)研究有待于更深入的開(kāi)展和豐富完善。基于此，本文總結(jié)了近年來(lái)利用SSR標(biāo)記技術(shù)在梨資源研究中的應(yīng)用及相關(guān)研究進(jìn)展，旨在為更好的利用SSR標(biāo)記進(jìn)行梨品種的遺傳育種研究提供參考。

1 SSR分子標(biāo)記

1.1 SSR分子標(biāo)記原理

SSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列，simple sequence repeats)分子標(biāo)記又稱(chēng)微衛(wèi)星標(biāo)記，由Moore等于1991年創(chuàng)立，是當(dāng)今生物學(xué)研究中最常用的分子標(biāo)記之一[14]。通常，SSR標(biāo)記是一類(lèi)由幾個(gè)核苷酸(一般為1～6個(gè))為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR標(biāo)記的原理是基于基因組中某一特定的微衛(wèi)星的側(cè)翼序列通常都是保守性較強(qiáng)的單一序列，而微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)量又存在高度變異，因而可以將微衛(wèi)星側(cè)翼的DNA片段進(jìn)行克隆和測(cè)序，再根據(jù)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列人工設(shè)計(jì)合成引物，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)微衛(wèi)星重復(fù)單位進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增檢測(cè)出存在差異的微衛(wèi)星位點(diǎn)。由于個(gè)體的擴(kuò)增產(chǎn)物在長(zhǎng)度上的變化而產(chǎn)生堿基長(zhǎng)度的多態(tài)性，這就是簡(jiǎn)單序列重復(fù)長(zhǎng)度多態(tài)性，即所謂的SSR擴(kuò)增多態(tài)性。

1.2 SSR標(biāo)記特點(diǎn)

研究發(fā)現(xiàn)，SSR標(biāo)記廣泛隨機(jī)的分布于真核生物中，大約每隔10～50 kb就有1個(gè)SSR[15]。與其它分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有這樣的幾個(gè)特點(diǎn)：(1)SSR標(biāo)記在全基因組上具有數(shù)量豐富，覆蓋廣；(2)SSR標(biāo)記具有多等位基因的特性，多態(tài)性高，提供的信息量高；(3)SSR標(biāo)記是以孟德?tīng)柗绞竭z傳，呈共顯性，可有效鑒別出基因的純/雜合位點(diǎn)；(4)SSR每個(gè)位點(diǎn)由設(shè)計(jì)的引物順序決定，其重演性好，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低；(5)SSR位點(diǎn)兩側(cè)的序列高度保守，設(shè)計(jì)合成的SSR引物通用性高；(6)SSR標(biāo)記對(duì)DNA的要求不高，需要的DNA量少，易于進(jìn)行PCR檢測(cè)，且適合于開(kāi)展高通量分析[16-17]。

2 SSR分子標(biāo)記在梨品種鑒定中的應(yīng)用

由于SSR標(biāo)記是呈共顯性標(biāo)記，利用SSR標(biāo)記檢測(cè)親本材料間位點(diǎn)的差異，就可以有效的將親本與雜交種區(qū)分開(kāi)。同時(shí)，基于SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高，重演性好以及易于操作檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，已被公認(rèn)為是植物新品種保護(hù)最廣泛應(yīng)用的標(biāo)記體系，目前已經(jīng)廣泛用于DNA指紋圖譜的構(gòu)建中[18]。至今為止，SSR技術(shù)已在梨品種資源鑒定中得到了大量的應(yīng)用。

Sawamura等[19]利用S-RNase等位基因和18個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)55份日本梨材料成功進(jìn)行了親本后代血緣關(guān)系鑒定。Kimura等[20]利用9個(gè)SSR標(biāo)記鑒別6個(gè)種60個(gè)亞洲梨，研究表明其中7個(gè)SSR標(biāo)記能將58個(gè)品種區(qū)分開(kāi)。Yamamoto等[21]利用蘋(píng)果SSR標(biāo)記鑒定包括19個(gè)日本梨，7個(gè)中國(guó)梨，5個(gè)歐洲梨，3個(gè)野生品種以及2個(gè)雜交品種的36個(gè)梨品種資源。結(jié)果表明，參試材料除突變體外，均可在檢測(cè)到的79個(gè)等位基因位點(diǎn)上相互鑒別開(kāi)來(lái)。此外，在構(gòu)建梨指紋圖譜方面，薛華柏等[7]利用SSR特征指紋數(shù)據(jù)，構(gòu)建了29個(gè)梨品種SSR特征指紋數(shù)據(jù)表，它可以直觀有效的對(duì)品質(zhì)進(jìn)行區(qū)分鑒定。張靖國(guó)等[22]以20個(gè)梨栽培品種為例，利用SSR標(biāo)記構(gòu)建梨分子身份證體系，根據(jù)引物對(duì)不同品種擴(kuò)增條帶大小進(jìn)行編碼，然后將每個(gè)品種17個(gè)SSR位點(diǎn)的賦值依次組合，建立了20個(gè)梨栽培品種的分子身份證。高源等[23]利用10對(duì)SSR熒光標(biāo)記引物，構(gòu)建了中國(guó)建國(guó)后選育的92個(gè)梨品種的指紋圖譜，選擇2～3對(duì)引物就可以區(qū)別不同品種。由此可見(jiàn)，SSR標(biāo)記用于梨屬資源鑒定，具有多態(tài)性高，分辨能力強(qiáng)的特點(diǎn)，在今后開(kāi)展梨品種資源保護(hù)和指紋圖譜構(gòu)建中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3 SSR分子標(biāo)記在梨遺傳多樣性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

遺傳多樣性是種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，前人利用SSR分子標(biāo)記對(duì)梨屬資源的遺傳多樣性進(jìn)行了相關(guān)研究。曹玉芬等[3]利用SSR技術(shù)對(duì)梨 41個(gè)栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，12對(duì) SSR引物擴(kuò)增出 114個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)9.5個(gè)，位點(diǎn)雜合度在 0.1517～0.7079之間，遺傳多樣性指數(shù)為0.4630。蔡丹英等[4]采用10對(duì)蘋(píng)果和3對(duì)梨上的SSR引物對(duì)來(lái)自溫嶺和麗水的18個(gè)地方梨品種類(lèi)型進(jìn)行了鑒定分析，結(jié)果表13對(duì)SSR引物的觀察雜和度(He)為0.056～0.944，平均值為0.57，而香農(nóng)指數(shù)(I)的范圍0.340～2.013，平均值為 1.22。劉清文等[24]利用覆蓋梨全基因組的134個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)45份西洋梨品種資源進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，共檢測(cè)到673個(gè)等位基因，每個(gè)SSR位點(diǎn)平均擴(kuò)增5.02個(gè)，45份參試西洋梨品種的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)以及Shannon信息指數(shù)(I)平均值分別為5.02、3.84、0.73、0.72和1.42。在梨屬資源的親緣關(guān)系鑒定上，曹玉芬等[3]利用系統(tǒng)聚類(lèi)分析將41個(gè)參試?yán)嫫贩N分為西洋梨和東方梨兩大類(lèi)。張東等[25]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)29個(gè)砂梨品種的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，并進(jìn)一步通過(guò)聚類(lèi)分析將29個(gè)砂梨品種分成4個(gè)組。Teng等[26]研究表明，中國(guó)長(zhǎng)江流域的野生砂梨可能是中國(guó)砂梨和日本梨系統(tǒng)的共同祖先。Cao等[27]和Tian等[28]對(duì)亞洲梨進(jìn)行SSR標(biāo)記分析，認(rèn)為原產(chǎn)中國(guó)的白梨，砂梨品種和日本砂梨品種相互交錯(cuò)，并且一些日本梨與中國(guó)砂梨親和力較高，表明中國(guó)砂梨和日本梨具有很近的親緣關(guān)系。此外，SSR標(biāo)記已經(jīng)利用到梨核心種質(zhì)資源圃的構(gòu)建中，這對(duì)于梨屬資源的收集保存也具有重要意義。卜海東等[29]利用梨資源的表型性狀和 SSR分子標(biāo)記相結(jié)合的方式，對(duì)寒地果樹(shù)資源圃的201份梨資源進(jìn)行核心種質(zhì)構(gòu)建研究，確定了36份資源為該圃的核心種質(zhì)資源，為寒地梨育種資源多樣性保護(hù)奠定了提供了保障。

4 SSR分子標(biāo)記在梨重要農(nóng)藝性狀的基因定位中的應(yīng)用

至今為止，SSR標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用與梨資源的遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位研究中。前人已經(jīng)利用不同的材料構(gòu)建了多張梨分子遺傳圖譜，這為梨資源的重要數(shù)量性狀基因定位奠定了基礎(chǔ)。Yamamoto等[30]在2002年利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了63株Bartlett×Hosui雜交F1的分子遺傳圖譜。韓明麗等[31]利用八月紅梨和碭山酥梨雜交得到的F1代實(shí)生苗為作圖群體構(gòu)建了一張包含有63個(gè)SSR標(biāo)記的分子遺傳圖譜。崔海榮[32]通過(guò)開(kāi)發(fā)砂梨的SSR標(biāo)記，結(jié)合EST-SSR和RAPD兩種標(biāo)記，構(gòu)建了砂梨“西子紅/喜水”F1群體的遺傳連鎖圖譜，并利用BSA法篩選出控制砂梨褐皮性狀的分子標(biāo)記CH05902，最終確定該標(biāo)記與控制褐色性狀位點(diǎn)的遺傳距離是4.6cM。田義軻等[33]以矮化梨與茌梨的F1 雜交分離群體為材料，利用BSA法，通過(guò)對(duì)40對(duì)SSR引物的篩選，獲得了一個(gè)與PcDw基因連鎖距離為9.3cM 的SSR標(biāo)記KA14210，由此將該基因定位到了梨品種‘Barlett’遺傳圖譜的第16連鎖群上。Wang等[34]在第16連鎖群上的51對(duì)SSR引物中篩選到一個(gè)與PcDw基因連鎖距離僅0.9 cM 的SSR標(biāo)記TsuENH022。宋偉等[35]以梨品種“黃金”和“碭山酥”的F1代雜交分離群體為試材，用分離群體分組分析法，獲得了與梨果實(shí)褐皮性狀相連鎖的SSR 標(biāo)記CH01c06 和Hi20b03，遺傳連鎖距離分別為4. 8 cM 和12. 0 cM。劉金義等[36]利用225對(duì)源自梨和蘋(píng)果基因組的SSR引物，結(jié)合分離群體分離分析法和選擇基因型分析法，對(duì)酸/低酸性狀進(jìn)行群體分離分析，結(jié)果表明，標(biāo)記KU10 與果實(shí)酸/低酸性狀連鎖，遺傳距離為12.15cM，并由此將果實(shí)酸/低酸性狀的QTL 初步定位到梨遺傳圖譜的第2 連鎖群上。Pierantoni 等[37]利用AFLP 和SSR標(biāo)記采用區(qū)間作圖法進(jìn)行了梨黑星病抗性QTL分析和定位，共檢測(cè)到3個(gè)梨黑星病抗性QTL位點(diǎn)，定位在母本圖譜的第3和第7連鎖群上，其最高貢獻(xiàn)率高達(dá)87.1%。Wu 等[38]利用SNP和SSR標(biāo)記對(duì)梨果實(shí)性狀進(jìn)行QTL定位分析，共發(fā)現(xiàn)與花梗長(zhǎng)度、單果重、果實(shí)縱徑、橫徑和可溶固形物5個(gè)性狀相關(guān)的14個(gè)QTL位點(diǎn)，分布在第 2、3、5、10、11、13、14 和 17 連鎖群，其貢獻(xiàn)率范圍為14%～30%。

5 SSR分子標(biāo)記在梨分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記輔助選擇育種是將現(xiàn)代分子生物學(xué)與傳統(tǒng)遺傳育種學(xué)有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，從而提高選擇效率和準(zhǔn)確性，縮短育種年限，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良。劉金義等[36]定位了一個(gè)SSR標(biāo)記KU10與果實(shí)酸/低酸性狀連鎖，為進(jìn)一步開(kāi)展梨果實(shí)酸/低酸性狀分子輔助育種奠定了基礎(chǔ)。宋偉等[39]利用“矮化梨”×(“茌梨”+“新高梨”)的F1代分離群體供試材料，通過(guò)對(duì)281對(duì)分別源自蘋(píng)果和梨基因組的SSR引物的BSA 篩選與群體分析，獲得了與梨果實(shí)形狀相關(guān)的SSR標(biāo)記CH02b10 和CH02f06，其對(duì)圓形/非圓形性狀判斷的符合率分別為91. 67% 和96. 67%。此外，Evans 等[40]在梨第17連鎖群上發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)與梨棉蚜抗性基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記NH006b 和NH014a，利用此標(biāo)記可進(jìn)行梨棉蚜抗性檢測(cè)。2011年，Wang等[34]篩選到一個(gè)SSR 標(biāo)記TsuENH022，它與PcDw基因連鎖距離僅0.9 cM，這也是到目前為止與梨所有農(nóng)藝性狀基因遺傳距離最近的標(biāo)記，可以用來(lái)進(jìn)行梨矮化性狀的標(biāo)記輔助選擇育種。目前，雖然SSR已應(yīng)用于梨的輔助選擇育種研究，但由于現(xiàn)有的與目標(biāo)性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記很少，所以有待于開(kāi)發(fā)合成新的SSR標(biāo)記，構(gòu)建新的高密度遺傳圖譜，定位出距離各連鎖群更近的基因，以提高標(biāo)記選擇的高效性和準(zhǔn)確性。

6 SSR分子標(biāo)記在梨研究中存在的問(wèn)題及應(yīng)用前景分析

由于梨樹(shù)為多年生植物，且基因型高度雜合，遺傳背景十分復(fù)雜，這些均給梨育種研究帶來(lái)困難。傳統(tǒng)育種往往根據(jù)表型選擇，盲目性較大，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠從DNA水平上有效的進(jìn)行闡述，是梨輔助遺傳育種研究的有力手段，能夠大大加快梨育種進(jìn)程，提高品種選育效率。目前來(lái)看，SSR標(biāo)記在梨研究中主要存在這樣的3個(gè)方面的問(wèn)題：(1)由于SSR標(biāo)記在梨研究中的應(yīng)用起步較晚，盡管當(dāng)前已經(jīng)構(gòu)建了許多梨資源的分子遺傳圖譜，但真正可以應(yīng)用于分子輔助育種的卻很少。(2)從梨屬植物基因組中開(kāi)發(fā)出的SSR引物較少，檢測(cè)的SSR位點(diǎn)數(shù)不足，尚未完全覆蓋整個(gè)梨的基因組，且許多SSR引物的檢測(cè)效果不好。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前超過(guò)500對(duì)引物能用于梨上，主要有梨的240對(duì)，蘋(píng)果的200對(duì)以及桃和甜櫻桃的65對(duì)，但利用頻率高，且效果的好的SSR引物有62對(duì)[41](表1)。(3)SSR標(biāo)記單獨(dú)無(wú)法準(zhǔn)確有效的區(qū)分芽變品種和原品種。

表1 62對(duì)梨高效SSR引物

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，梨分子標(biāo)記的研究已取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。相信未來(lái)會(huì)有越來(lái)越多的梨SSR分子標(biāo)記被開(kāi)發(fā)和利用起來(lái)，這必將進(jìn)一步促進(jìn)梨遺傳圖譜的構(gòu)建和重要農(nóng)藝性狀基因的定位和克隆，最終為實(shí)現(xiàn)梨分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

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ApplicationofSSRMolecularMarkerinPearGeneticsandBreedingResearch

Feng Zhangli,Liu Chang,Gu Guangjun,Cheng Xianmin,Liu Yanjie,Bu Haidong,Yu Wenquan

(Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Mudanjiang,Heilongjiang 157041)

We summarized the application of SSR molecular markers in pear cultivars,including identification of pear variety,diversity of germplasm resources evaluation,gene mapping of important agronomic traits and marker-assisted selection breeding four aspects,and further analyzed the current main problems of SSR markers research and application prospects in the pear. The aim is to provide references for developing pear molecular genetic breeding in future.

SSR; Pear;Genetics and breeding; Application

2017-06-09

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(CARS-28)

馮章麗(1984-)，女，助理研究員，碩士，主要從事寒地果樹(shù)育種研究，E-mail：ffzzl-0319@163.com;*通訊作者：于文全。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.06.032

S661.2

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