王鳴 韓文正 關(guān)韶峰 翟馨蓉 方唯一 曲新凱

基礎(chǔ)研究

不同劑量苯酚去腎交感神經(jīng)術(shù)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響

王鳴 韓文正 關(guān)韶峰 翟馨蓉 方唯一 曲新凱

目的 探討不同劑量苯酚去腎交感神經(jīng)術(shù)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓影響。方法 選用12周齡自發(fā)性高血壓大鼠，腎動(dòng)靜脈局部涂抹不同劑量的苯酚，按照給藥劑量分為4組：假手術(shù)組、0.5 ml苯酚組、1.0 ml苯酚組和1.5 ml苯酚組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，監(jiān)測(cè)血壓，1周后行苯酚化學(xué)腐蝕神經(jīng)術(shù)，術(shù)后4周處死大鼠，采血，腎動(dòng)脈及腎神經(jīng)組織送檢。采用ELISA法測(cè)定血漿去甲腎上腺素含量，腎動(dòng)脈采用HE、Masson、PAS染色，腎神經(jīng)采用免疫組化酪氨酸羥化酶染色及神經(jīng)絲蛋白染色。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，術(shù)后4 周，1.0 ml苯酚組血壓顯著降低［（163.60±5.87）mm Hg 比（193.70±6.07）mm Hg，P＜0.01］，血漿去甲腎上腺素含量顯著降低［（50.50±31.01）ng/L 比（197.50±35.27）ng/L，P＜0.01］；HE 染色，腎動(dòng)脈輕度損傷，神經(jīng)中度損傷（3.46±0.30 比 0.44±0.30，P＜0.01），酪氨酸羥化酶低表達(dá)（0.51±0.30 比 2.58±0.30，P＜0.01），神經(jīng)絲蛋白高表達(dá)（2.27±0.30 比 0.09±0.10，P＜0.01）。結(jié)論 1.0 ml苯酚化學(xué)腐蝕神經(jīng)術(shù)能夠有效損傷腎神經(jīng)，顯著降低血壓，且不造成腎動(dòng)脈狹窄，其機(jī)制可能與腎交感神經(jīng)酪氨酸羥化酶活性低有關(guān)。

去腎交感神經(jīng)；高血壓；苯酚；酪氨酸羥化酶

交感神經(jīng)亢進(jìn)是高血壓發(fā)生的重要機(jī)制之一。20世紀(jì)50年代，有研究者采用手術(shù)完全切斷交感神經(jīng)的非藥物方式來(lái)治療高血壓，發(fā)現(xiàn)能顯著降低血壓，但卻帶來(lái)嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。2009年Krum等[2]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮腎動(dòng)脈消融術(shù)射頻消融能有效控制難治性高血壓。隨后HTN-2（Simplicity Hypertension 2）的成功進(jìn)一步地證實(shí)了去腎交感神經(jīng)術(shù)的安全性和有效性[3]。但 HTN-3（Simplicity Hypertension 3）的失敗對(duì)腎動(dòng)脈射頻消融技術(shù)的可行性提出了質(zhì)疑[4]，其中一個(gè)主要問(wèn)題是神經(jīng)的消融程度不明確[5]，尤其在大鼠去腎交感神經(jīng)模型上，既往研究采用經(jīng)典苯酚化學(xué)腐蝕腎交感神經(jīng)，但消融細(xì)節(jié)不明確，沒(méi)有一個(gè)消融標(biāo)準(zhǔn)，消融程度時(shí)間也不同[6-8]，因而結(jié)果也不盡相同。本課題利用苯酚化學(xué)腐蝕神經(jīng)法來(lái)建立自發(fā)性高血壓大鼠去腎交感神經(jīng)模型，探討合理苯酚消融時(shí)間、濃度和劑量。

1 材料與方法

1.1 主要材料 雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR），12 周齡，40 只，由上海斯萊克有限公司提供，分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)操作流程均符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用守則。去甲腎上腺素（NE）ELISA試劑盒購(gòu)買于上海鈺博生物科技有限公司；神經(jīng)絲蛋白（NF200）抗體（abcam官網(wǎng)，編號(hào) ab82259），酪氨酸羥化酶（TH）抗體（abcam 官網(wǎng)，編號(hào) ab112）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將SHR大鼠隨機(jī)分為4組：①假手術(shù)組，生理鹽水擦拭腎動(dòng)脈（n=10）；②手術(shù)組（共3組），分別用苯酚擦拭腎動(dòng)脈 1 min（0.5 ml）、2 min（1.0 ml）、3 min（1.5 ml），每組各 10 只。術(shù)前及術(shù)后每周無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈測(cè)血壓；4周后處死大鼠，留取血漿測(cè)去甲腎上腺素含量，腎動(dòng)脈、腎神經(jīng)組織送檢。

1.2.2 去腎交感神經(jīng)方法 腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，備皮，消毒鋪巾，腹白線正中切開(kāi)，逐層分離皮下組織及肌肉，暴露腎門，游離腎動(dòng)脈，在顯微鏡下（×25）剝離腎動(dòng)脈表面所有結(jié)締組織，同時(shí)用棉簽蘸溶于95%乙醇的10%苯酚溶液，涂抹雙側(cè)腎動(dòng)靜脈表面，分別用0.5 ml涂抹1 min，1.0 ml涂抹 2 min，1.5 ml涂抹 3 min。假手術(shù)僅暴露腎門，不剝離動(dòng)靜脈鞘，僅用生理鹽水涂抹。逐層縫合傷口，術(shù)后給予青霉素80萬(wàn)U 3 d，預(yù)防感染。

1.2.3 血壓測(cè)量 應(yīng)用大鼠無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈測(cè)壓計(jì)（BP-2000 SERIESⅡ）測(cè)量血壓。室溫（22±2）℃，將大鼠放置固定裝置中，測(cè)量?jī)x的尾部氣囊套入鼠尾，待大鼠安靜后，緩慢加熱至39℃使鼠尾血管擴(kuò)張，同時(shí)將四通道采集儀連接電腦，待電腦采集信號(hào)穩(wěn)定后，充氣加壓，直至脈搏信號(hào)成一條直線，然后逐漸放棄減壓，待出現(xiàn)規(guī)則波形信號(hào)時(shí)，電腦顯示數(shù)值。每只大鼠重復(fù)3次，間隔30 min，測(cè)平均值。

1.2.4 血漿去甲腎上腺素測(cè)定及腎動(dòng)脈、腎交感神經(jīng)病理檢驗(yàn) 4周后處死大鼠，心臟采血，血液標(biāo)本均以3000 r/min離心15 min，分離出血漿，采用ELISA法測(cè)定血漿去甲腎上腺素（去甲腎上腺素試劑盒購(gòu)于上海鈺博生物科技有限公司），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。取左側(cè)腎動(dòng)脈，行石蠟固定包埋切片HE染色，同時(shí)腎交感神經(jīng)染色采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TH和NF200表達(dá)情況。每張切片隨機(jī)取10個(gè)視野進(jìn)行拍照。

光鏡下評(píng)估神經(jīng)損傷，采取半定量評(píng)分法。0分：無(wú)損傷，正常形態(tài)。1分：極輕度損傷，神經(jīng)束外膜少量炎癥反應(yīng)，纖維化，神經(jīng)束少許空泡化。2分：輕度損傷，神經(jīng)束外膜部分炎癥反應(yīng)，纖維化，神經(jīng)束部分空泡化，伴核固縮，軸索損害，出現(xiàn)極少量髓鞘消解腔。3分：中度損傷，神經(jīng)束外膜中度炎癥反應(yīng)，纖維化，神經(jīng)束重度空泡化，部分核固縮，出現(xiàn)髓鞘消解腔，腫脹。4分：重度損傷，神經(jīng)束外膜嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，纖維化，神經(jīng)束正常結(jié)構(gòu)消失、壞死、纖維化。

免疫組化NF200和TH染色同樣采用半定量積分法。0分：對(duì)TH或NF200完全無(wú)反應(yīng)，無(wú)染色。1分：對(duì)TH或NF200微弱反應(yīng)，染色弱陽(yáng)性。2分：對(duì)TH或NF200有反應(yīng)，染色陽(yáng)性。3分：對(duì)TH或NF200強(qiáng)烈反應(yīng)，染色強(qiáng)陽(yáng)性。

腎動(dòng)脈損傷半定量評(píng)分法。0分：正常形態(tài)。1分：極輕度損傷，內(nèi)膜丟失小于血管周徑25%，中膜損傷范圍小于血管周徑25%，損傷深度小于中膜25%。2分：輕度損傷，內(nèi)膜丟失介于血管周徑25%～50%，中膜損傷范圍介于血管周徑25%～50%，損傷深度介于中膜25%～50%。3分：中度損傷，內(nèi)膜丟失介于血管周徑50%～75%，中膜損傷范圍介于血管周徑50%～75%，損傷深度介于中膜50%～75%。4分：重度損傷，內(nèi)膜丟失大于血管周徑75%，中膜損傷范圍大于血管周徑75%，損傷深度大于中膜75%；或者中膜變薄小于中膜50%[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，組間比較采用one-way ANOVA，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組等級(jí)資料比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況 1.5 ml苯酚組術(shù)后第7天、第9天各死亡1只大鼠，均死于腸梗阻，腹腔感染；假手術(shù)組及 0.5 ml、1.0 ml苯酚組無(wú)死亡。

2.2 各組大鼠收縮壓的變化 術(shù)前，SHR大鼠基線血壓各組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。去腎交感神經(jīng)術(shù)后1周，手術(shù)組大鼠血壓較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.01）。術(shù)后 2～4 周，1.5 ml組大鼠收縮壓較假手術(shù)組逐漸增高（P＜0.01），而 1.0 ml組大鼠與假手術(shù)組相比，收縮壓顯著降低（P＜0.01），0.5 ml組大鼠與假手術(shù)組相比未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 血漿去甲腎上腺素變化 術(shù)后4周，假手術(shù)組、0.5 ml組、1.5 ml組大鼠血漿去甲腎上腺素含量比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而 1.0 ml組大鼠血漿去甲腎上腺素較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 RDN術(shù)后各組大鼠血壓和血清指標(biāo)變化（±s）

表1 RDN術(shù)后各組大鼠血壓和血清指標(biāo)變化（±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.01，bP＜0.05

收縮壓（mm Hg）組別 例數(shù)術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后3周 術(shù)后4周假手術(shù)組 10 175.90±5.89 177.50±5.28 184.30±4.74 190.50±4.28 193.70±6.07 197.50±35.27 0.5 ml苯酚組 10 178.30±5.69 169.40±7.71a 181.00±4.37 187.10±4.23 192.20±3.94 218.40±33.71 1.0 ml苯酚組 10 179.10±5.51 167.60±4.35a 172.10±5.13a 165.90±4.56a 163.60±5.87a 50.50±31.01a 1.5 ml苯酚組 10 175.30±4.83 169.00±6.88a 189.70±5.11a 195.70±3.71a 200.00±7.11b 174.90±33.32去甲腎上腺素（ng/L）術(shù)后4周

2.4 腎動(dòng)脈組織學(xué)變化 對(duì)左側(cè)腎動(dòng)脈進(jìn)行HE、Masson、PAS 染色后發(fā)現(xiàn)，1.5 ml組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)膜明顯增厚并向管腔突出，平滑肌細(xì)胞增生，細(xì)胞排列紊亂，中膜平滑肌增生，血壁破壞，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；而假手術(shù)組、0.5 ml組、1.0 ml組大鼠腎動(dòng)脈內(nèi)膜未見(jiàn)明顯增生，血管內(nèi)皮及內(nèi)膜下彈力纖維完整。腎動(dòng)脈損傷評(píng)分：1.5 ml苯酚組中重度損傷，其余各組正常至輕度損傷。見(jiàn)圖1，表2。

2.5 腎交感神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化 HE染色下，假手術(shù)組為正常腎動(dòng)脈外周交感神經(jīng)；0.5 ml苯酚組腎交感神經(jīng)輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)束外膜破裂不完整；1.0 ml組和 1.5 ml組中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化，核空泡化，核萎縮，部分神經(jīng)細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)消失。

免疫組化檢測(cè)：假手術(shù)組及0.5 ml組NF200表達(dá)低，而 1.0 ml組和 1.5 ml組表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。假手術(shù)組及 0.5 ml組TH 高表達(dá)，而 1.0 ml組和 1.5 ml組低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖2，表2。

表2 RDN術(shù)后各組大鼠腎動(dòng)脈和腎交感神經(jīng)損傷評(píng)分（±s）

表2 RDN術(shù)后各組大鼠腎動(dòng)脈和腎交感神經(jīng)損傷評(píng)分（±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.01

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3 討論

腎臟神經(jīng)支配豐富，主要分為傳入神經(jīng)和傳出神經(jīng)。傳入神經(jīng)大部分起源于腎盂管壁，感受機(jī)械和化學(xué)刺激，接受T6～L4脊髓的交感神經(jīng)節(jié)后纖維支配，并將感受信息傳入中樞下丘腦和延髓頭端腹外側(cè)區(qū)[10]，繼而通過(guò)傳出神經(jīng)刺激β1腎上腺素受體增加腎素的分泌；刺激α1腎上腺素受體增加腎小管的水鈉重吸收；刺激α1受體降低腎血流的灌注，從而影響血壓[11]。然而由于缺乏評(píng)價(jià)腎交感神經(jīng)消融程度的即刻指標(biāo)，無(wú)論是臨床試驗(yàn)還是動(dòng)物模型，術(shù)后結(jié)果不盡相同[5,7,12]。本實(shí)驗(yàn)采用苯酚消融方法，通過(guò)腎交感神經(jīng)病理染色結(jié)合血漿去甲腎上腺素，從形態(tài)學(xué)和功能上探討大鼠腎交感神經(jīng)消融模型苯酚的使用量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用1.0 ml苯酚溶液棉簽擦拭腎交感神經(jīng)能夠有效腐蝕神經(jīng)，降低血壓，而不損傷腎動(dòng)脈，有助于提高建模成功率及有效率。

既往有研究者在動(dòng)物模型中采用電刺激腎交感神經(jīng)，通過(guò)即刻觀察腎血流量變化來(lái)證明手術(shù)有效性，發(fā)現(xiàn)采用 15 V，0.2 ms和 10 Hz，30 s兩種刺激方法腎血流量未見(jiàn)明顯改變[12]；也有研究采用腎臟組織中去甲腎上腺素含量低于對(duì)照組10%來(lái)作為去神經(jīng)成功的標(biāo)準(zhǔn)[7]。TH是機(jī)體兒茶酚胺的限速酶，反映局部組織交感活性。Burgi等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，TH可作為交感神經(jīng)活性的標(biāo)志，反映交感神經(jīng)活性與血壓之間的關(guān)系，去神經(jīng)后TH表達(dá)下降。NF是神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)蛋白，主要分布在神經(jīng)元的胞體及突起內(nèi)，NF200作為其中一種亞型，在正常情況下只存在于軸索中，胞體很少含有，正常神經(jīng)NF200染色為陰性，神經(jīng)損傷后NF200可出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。因此本實(shí)驗(yàn)采用腎交感神經(jīng)HE染色及TH、NF200免疫組織化學(xué)染色同時(shí)結(jié)合血漿腎素含量來(lái)作為去神經(jīng)成功的標(biāo)準(zhǔn)。

苯酚是一種強(qiáng)烈的化學(xué)腐蝕劑，可引起蛋白質(zhì)發(fā)生凝固性壞死。本實(shí)驗(yàn)利用苯酚對(duì)神經(jīng)的化學(xué)毀損，以達(dá)到去神經(jīng)目的。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：①與假手術(shù)組相比，1.0 ml和 1.5 ml苯酚組神經(jīng)毀損明顯，0.5 ml苯酚組神經(jīng)僅有輕度損傷，術(shù)后4周未見(jiàn)神經(jīng)再生；②術(shù)后1周與對(duì)照組相比，手術(shù)組血壓均有不同程度降低，可能是去神經(jīng)后動(dòng)脈管壁牽張程度降低，壓力感受器受抑制，從而中樞交感系統(tǒng)抑制解除[14]，也可能與圍術(shù)期進(jìn)食量少有關(guān)；③術(shù)后4個(gè)月與假手術(shù)組相比，只有1.0 ml苯酚組血壓下降，0.5 ml苯酚組血壓無(wú)下降趨勢(shì)，而 1.5 ml苯酚組血壓明顯升高，血漿去甲腎上腺素與血壓變化趨勢(shì)一致。通過(guò)進(jìn)一步腎動(dòng)脈病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1.5 ml苯酚組大鼠腎動(dòng)脈狹窄明顯，其余各組無(wú)腎動(dòng)脈狹窄。1.5 ml苯酚組術(shù)后有2只大鼠死于腸梗阻，考慮苯酚使用過(guò)量、接觸時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致神經(jīng)過(guò)度消融，進(jìn)而腐蝕腎動(dòng)脈造成腎動(dòng)脈狹窄，引起腎性高血壓，同時(shí)過(guò)量的苯酚也破壞腎動(dòng)脈周圍組織，如回腸及直腸黏膜，引起機(jī)械性腸梗阻。另外0.5 ml苯酚組大鼠神經(jīng)輕度損傷，血壓無(wú)下降趨勢(shì)，表明0.5 ml苯酚量不足以對(duì)腎神經(jīng)有效腐蝕。

綜上所述，本研究通過(guò)苯酚腐蝕神經(jīng)法建立去腎交感神經(jīng)模型，觀察不同劑量苯酚溶液對(duì)神經(jīng)腐蝕的程度，血壓的變化，發(fā)現(xiàn)采用1.0 ml苯酚溶液棉簽擦拭腎交感神經(jīng)2 min可以有效腐蝕神經(jīng)達(dá)到去腎交感神經(jīng)目的，并不造成腎動(dòng)脈狹窄，術(shù)后4周內(nèi)血壓逐漸下降，且未見(jiàn)神經(jīng)再生，血漿去甲腎上腺素含量降低，病理證實(shí)酪氨酸羥化酶表達(dá)降低，因此血壓下降可能與去神經(jīng)后交感神經(jīng)活性降低有關(guān)。在后續(xù)研究中，我們將對(duì)RDN治療的自發(fā)性高血壓大鼠進(jìn)行分子生物學(xué)檢查，深入探討RDN降低大鼠血壓的作用機(jī)制。

（本文圖片見(jiàn)后插二）

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Effect of renal sympathetic denervation with different dose phenol on blood pressure in spontaneous hypertension rats

WANG Ming，HAN Wen-zheng，GUAN Shao-feng，et al.Department of Cardiology，Shanghai Chest Hospital，Shanghai 200030，China

QU Xin-kai，E-mail：qxkchest@126.com

ObjectiveTo investigate the impact of renal sympathetic denervation（RDN）with a suitable dosage of phenol on the blood pressure，plasma noradrenaline and renal nerves injury in spontaneous hypertension rats（SHRs）.MethodsMale SHRs were randomly divided into four groups：the 0.5 ml phenol group which was subjected to RDN at the age of 13 weeks；the 1.0 ml phenol group；1.5 ml phenol group and the Sham group which underwent the sham procedure（n=10，each group）.Blood pressure was measured every week using the tailcuff plethysmography.Four weeks after the RDN or sham operation，plasma norepinephrine（NE）were assessed.Kidney artery and nerve tissue were collected and characterized by immunohistochemically analyses.ResultsCompared with Sham group，the 1.0 ml phenol group with RDN significantly attenuated the progressive increase in blood pressure ［（163.60±5.87）mm Hg vs（193.70±6.07）mm Hg，P ＜0.01］and decreased plasma NE level［（50.50±31.01）ng/L vs（197.50±35.27）ng/L，P＜0.01］.The result of HE staining showed mild injury of renal artery in 1.0 ml phenol group and moderate to severe injury in 1.5 ml phenol group，while severe injury of renal nerves were occurred in 1ml phenol group and 1.5 ml phenol group.RDN treatment also inhibited the expression of tyrosine hydroxylase（TH）and increased the expression of neurofilament protein（NF200）in renal nerves in 1ml phenol group compared with sham group［TH score：0.51±0.30 vs 2.58±0.30，P＜0.01；NF200 score：2.27±0.30 vs 0.09±0.10，P＜0.01］.ConclusionRDN with 1.0 ml phenol can effectively destroy the renal nerves without renal arterial stenosis and decrease blood pressure in SHRs，which might be associated with inhibition of expression of TH.

Renal sympathetic denervation；Hypertension；Phenol；Tyrosine hydroxylase

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：81370361）；上海市科委（項(xiàng)目編號(hào)：12140902800）；上海市申康醫(yī)院發(fā)展中心（項(xiàng)目編號(hào)：SHDC12012101）；上海市胸科醫(yī)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2014YZDH20300）

200030 上海市，上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院心內(nèi)科

曲新凱，E-mail：qxkchest@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.11.020

Q95-33；R544.1

A

1672-5301（2017）11-1036-04

2017-07-18)