李林杰 ，李新洲 ，肖忠玉 ，楊洪娟 ，王 凱 ，許美玲

（1.日照出入境檢驗檢疫局，山東日照276800；2. 海陽市海洋與漁業(yè)局，山東海陽265100）

進口大豆中麥角鑒定方法新研究

李林杰1，李新洲2，肖忠玉1，楊洪娟1，王 凱1，許美玲1

（1.日照出入境檢驗檢疫局，山東日照276800；2. 海陽市海洋與漁業(yè)局，山東海陽265100）

我國進口大豆逐年迅猛增多，針對進口大豆中麥角和菌核難以鑒定的現(xiàn)狀進行分析研究。根據(jù)麥角中毒性成分主要是麥角胺、麥角生堿和麥角新堿等成分，比較了食品領(lǐng)域中麥角生物堿不同檢測方法的優(yōu)缺點，選擇快速有效的檢測方法。根據(jù)現(xiàn)狀提出3種研究方法：第1種是傳統(tǒng)感官生物堿顯色法，參考GB 2715-2016《食品安全國家標準糧食》中的檢測方法；第2種是液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，結(jié)合食品領(lǐng)域中麥角生物堿的檢測方法，采用提取、分離、純化、成分分析等步驟；第3種是分子生物學(xué)方法。對麥角菌核酸的制備提取，然后采用普通PCR儀或者熒光定量PCR進行分析檢測。研究為病原菌的檢驗鑒定提供了一種新的思路，采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法對病原菌產(chǎn)生的致病物質(zhì)進行分析，豐富了植物病原菌的檢驗鑒定理論。首次提出對麥角菌利用分子生物學(xué)原理進行鑒定，為鑒別進口大豆中的菌核與麥角提供了一個新的標準，為一線人員提供鑒定基礎(chǔ)。

菌核；麥角生物堿；液相色譜--質(zhì)譜//質(zhì)譜法；麥角菌；分子生物學(xué)；PPCCRR

近年來，隨著我國人民生活水平的提高，我國大豆進口貿(mào)易也得到迅猛發(fā)展，進口大豆呈現(xiàn)出持續(xù)增長的勢頭，屢創(chuàng)新高，僅2016年進口大豆8 391萬t，預(yù)計2017年將超過9 000萬t。進口大豆的同時伴隨攜帶昆蟲、雜草籽、病害、有害有毒物質(zhì)、品質(zhì)不合格等大量問題出現(xiàn)。其中進口大豆中不斷檢出的黑色鼠糞狀的物質(zhì)，極可能是大豆菌核病菌的菌核或麥角。由于大豆菌核病菌的菌核和麥角在形態(tài)上相似，對兩者的鑒定一直存在一定的困難，是目前困擾口岸檢驗檢疫人員的一個問題。

進口大豆中檢出的黑色鼠糞狀的物質(zhì)以大豆菌核病菌的菌核居多，很多口岸也曾在進口大豆中檢出菌核。在實際鑒定過程中，經(jīng)常從進口大豆中檢出小麥、大麥、黑麥草、雀麥等禾本科雜草，所以黑色物質(zhì)是麥角的可能性也很大，而且很多口岸確實曾從美國、巴西大豆中多次檢出麥角菌。人或牲畜若誤食了含有麥角的糧食作物，會引發(fā)壞疽性麥角中毒和痙攣性麥角中毒[1]。根據(jù)GB 2715-2016《食品安全國家標準糧食》和GB 19641-2005《植物油料衛(wèi)生標準》規(guī)定，大豆中不得檢出麥角，因此對進口大豆中的黑色鼠糞狀的物質(zhì)進行鑒定具有重大意義。

隨著各類學(xué)科交叉發(fā)展，植物檢疫方法不局限于傳統(tǒng)的感官檢驗，分子生物學(xué)的應(yīng)用已經(jīng)普及，化學(xué)分析的方法還待開發(fā)利用。常見的有關(guān)麥角的鑒定只是停留在2003年制定的標準GB/T5009.36-2003《糧食衛(wèi)生標準的分析方法》及最新的GB 2715-2016《食品安全國家標準糧食》，對疑似物質(zhì)進行感官和麥角紅素與麥角生物堿定性檢測，新的標準只是對這一過程進行了優(yōu)化。在食品方面的研究領(lǐng)域中[2-3]，對麥角生物堿的研究，主要有以下幾個方面：比色分析法（Colorimetry），但此方法只適合總堿含量測定，不能區(qū)分麥角生物堿的差向異構(gòu)體；薄層色譜分析法（Thin layer chromatography，TLC）分析方法簡便、快速、成本低，但靈敏度低、重現(xiàn)性差，因此目前多用于定性分析及半定量分析；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），具有檢測時間短、特異性強、儀器設(shè)備和樣品前處理簡單的特點，適用于大批量樣品篩查與現(xiàn)場檢測，然而也存在酶標記抗體保存時間有限且用量大，交叉反應(yīng)，可能出現(xiàn)假陽性和假陰性等弊端；氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）一般要求被分析物在一定溫度下易氣化且在氣化溫度下較穩(wěn)定。采用GC檢測肽型麥角生物堿時，肽型麥角生物堿在進樣口溫度（250～300℃）下不穩(wěn)定、易分解，肽型麥角生物堿會發(fā)生熱分解，產(chǎn)生縮氨酸部分。利用質(zhì)譜法（Mass spectrometer，MS）可以區(qū)分肽型麥角生物堿和其他麥角生物堿，但對于肽型麥角生物堿的差向異構(gòu)體，如：麥角胺和麥角胺寧，則不能進行區(qū)分；高效液相色譜分析法（High performance liquid chromatography，HPLC），該方法具有分析效率高、重現(xiàn)性好、專一性強、靈敏度高等優(yōu)點，是目前常用的一種麥角生物堿的檢測方法，該方法不宜鑒定新化合物、區(qū)分特征麥角生物堿及其異構(gòu)體；儀器聯(lián)用分析法，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、電離子質(zhì)譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/ESI-MS/MS）等方法，集合了2種方法的優(yōu)點，提高分析的自動化程度。其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/ESI-MS/MS）應(yīng)用廣泛，這種方法能定量分析麥角生物堿的同時確定麥角生物堿的相對分子質(zhì)量，還可能得到新的化合物。從植物檢疫角度介紹3種對疑似物質(zhì)進行鑒定的實驗方法的初步研究，為鑒別菌核與麥角提供思路。

1 GB 2715-2016《食品安全國家標準糧食》

1.1 形態(tài)鑒定特征

麥角呈香蕉形或大麥形，有時略扁，長3～10 mm，外面呈黑色或紫黑色，有縱溝與橫裂紋，質(zhì)脆，易折斷，斷面扁形、鈍多邊形或橢圓形，中心呈白色、灰白或粉白色，四周呈淺紫色。

1.2 麥角紅素和麥角生物堿定性

1.2.1 原理

采用比色法進行麥角紅素和麥角生物堿檢查。麥角紅素在飽和碳酸氫鈉溶液中顯紅色，麥角生物堿的三氯甲烷提取液與對二甲氨基苯甲醛接觸后，呈藍紫色環(huán)，數(shù)分鐘后三氯甲烷層顯藍色，且在365 nm紫外光燈下，其乙醇溶液顯藍色熒光。

1.2.2 步驟

取可疑麥角樣品0.5 g，置于研缽中研碎，加2%酒石酸溶液研磨成黏稠狀后，加無水乙醚5 mL反復(fù)研磨，合并乙醚于試管中。在含乙醚的試管內(nèi)加0.5 mL飽和碳酸氫鈉溶液，振搖，碳酸氫鈉溶液層顯紅色，即表示檢出麥角紅素。以健康小麥為陰性對照。

在有殘渣的研缽中，加氨水（1∶1）研磨呈堿性，用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷層，混勻后分成2份，分別置于2支試管中。取其中1份，沿管壁緩慢加入2 mL對二甲氨基苯甲醛溶液，在兩溶液接觸面呈藍紫色環(huán)，數(shù)分鐘后，三氯甲烷層均顯藍色，即表示檢出麥角生物堿。

取另一份試管于熱水浴上加熱，使三氯甲烷揮盡，殘留物加無水乙醇溶解，在波長365 nm紫外光燈下觀察，顯強烈藍色熒光，即表示檢出麥角生物堿。以健康小麥為陰性對照判定。

在麥角鑒定的基礎(chǔ)上，麥角紅素和麥角生物堿定性檢查呈陽性，則可判定在試樣中檢出麥角[4-6]。

2 液相色譜——質(zhì)譜/質(zhì)譜法

2.1 原理

根據(jù)麥角的成分比較復(fù)雜，其毒性成分主要是麥角胺、麥角生堿和麥角新堿等麥角生物堿。通過測定麥角生物堿的含量，便可以確定該疑似物質(zhì)為麥角而不是菌核。

2.2 麥角生物堿的提取與分離純化

提取粉碎樣品后，稱取4 g于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-碳酸銨混合溶液（84/16，v/v），振蕩提取30 min，在4℃，10 000 r/min，離心10 min，上清液過濾，待純化。

純化取4 mL濾液加入試管中，緩慢推入MycoSep?150麥角生物堿多功能凈化柱，直至試管底部，量取凈化柱管內(nèi)洗脫液0.5 mL于另一試管中，再加入0.5 mL碳酸銨溶液（3 mmol/L），混合均勻，通過微孔濾膜（0.2 μm）過濾至進樣小瓶，待上機分析測定[7-8]。

2.3 測定

2.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Gemini-NX 3u C18（100 mm×2.0 mm（i.d.），3 μm）液相色譜柱或相當者。

流動相：A-乙腈，B-碳酸銨溶液（3 mmol/L）。

柱溫：30℃。

流速：0.3 mL/min。

進樣量：5 μL。

梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相及梯度洗脫條件

2.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離（ESI）。

掃描方式：正離子掃描。

電噴霧電壓、離子源溫度、霧化氣、輔助氣、氣簾氣和碰撞氣均為高純氮氣，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。

監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

2.3.3 定性測定

按照上述儀器條件測定樣品和標準液，如果檢出的質(zhì)量色譜峰保留時間與標準樣品一致，并且在扣除背景后的樣品譜圖中，各定性離子的相對豐度與濃度接近的同樣條件下得到的標準溶液譜圖相比，最大允許相對偏差不超過±30%，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物。說明此物質(zhì)含有麥角生物堿，該疑似物為麥角。

3 分子生物學(xué)方法

麥角菌屬于真菌子囊菌亞門，核菌綱，球殼目，麥角菌科，麥角菌屬[9]。

3.1 麥角菌核酸的制備提取

稱取經(jīng)液氮處理的疑似麥角物質(zhì)粉末0.1 g，移到滅菌的2.0 mL離心管中[10]。加入0.7 mL CTAB提取液。置于水浴鍋中65℃水浴30 min，期間不斷混勻；

加入5 μL 10 mg/mL RNA酶，充分混勻，在37℃放置30 min；

加入等體積的Tris飽和酚，充分搖勻，在12000r/min下離心15 min；

取上清液，加入等體積三氯甲烷-異戊醇混合液（24/1，v/v），在12 000 r/min下離心15 min（重復(fù)2次）；

加入等體積的預(yù)冷異丙醇，輕輕搖晃，置于-20℃冰箱靜置30min，在12000r/min下離心15min；

棄上清液，加入70%乙醇0.5 mL，在12 000 r/min下離心3 min，去上清液，重復(fù)2次。

制得DNA沉淀，用冷凍干燥器進行干燥，加入30～50 μL TE或無菌去離子水，充分溶解后置于-20℃下冰箱中保存（或者應(yīng)用DNA提取試劑盒法）。

3.2 DNA純度和濃度的測定

用核酸蛋白分析儀分別在260和280 nm下測定OD值，用于PCR反應(yīng)的DNA純度一般為1.6≤OD260/OD280≤2.0。

3.3 麥角菌核酸標準樣品的選擇

選擇麥角菌陽性核酸的標準樣品。

3.4 PCR檢測

3.4.1 熒光定量PCR檢測

（1）選擇合適的引物和探針

設(shè)計特異性引物和探針，在TaqDNA聚合酶的作用下進行擴增[11]。

（2）PCR擴增條件

95℃變性30 s，95℃變性5 s、60℃退火30 s，共40個循環(huán)，最后50℃冷卻30 s。

（3）結(jié)果判定

通過熒光定量PCR進行陰陽性對照，根據(jù)檢測Ct值的大小，確定該物質(zhì)是否為麥角菌的DNA從而確定該物質(zhì)為麥角。

3.4.2 普通PCR檢測

（1）選擇通用引物

利用真菌ITS通用引物對ITS4（5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'）和 ITS5（5'GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3'）進行PCR 擴增[12]。

（2）擴增條件

94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

（3）擴增步驟

PCR反應(yīng)可以使用天根產(chǎn)的2*TaqMasterMix試劑盒進行擴增；也可以自配25 μL體系擴增，包括2.5 μL 10 × PCR buffer（Mg2+free），2.0 μL Mg2+（2 mmol/L），2.0 μL dNTP（各200 μmol/L），1 μL上下游引物（10 μmol/L），2 μL模板DNA，1.5 UTaq聚合酶（5 U/μL），加水至25 μL。

以無菌去離子水為空白對照，以提供的陽性對照的DNA為陽性對照，每個樣品重復(fù)2次。

（4）結(jié)果判定

PCR擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，點樣5 μL，用1×TAE電泳緩沖液在100 V的電場下電泳30 min左右，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析純化回收條帶送公司測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，以確定是否為麥角菌的DNA，從而確定該物質(zhì)是否為麥角。

4 結(jié)論

目前進行麥角鑒定的方法只是先通過傳統(tǒng)的感官檢驗鑒定，發(fā)現(xiàn)可疑樣品，然后進一步進行麥角紅素與麥角生物堿定性檢測，該方法需樣品量大，過程方法比較復(fù)雜，在實際操作中顯色現(xiàn)象不明顯，況且進口大豆中發(fā)現(xiàn)的樣品數(shù)量本來就少，檢疫鑒定困難進一步加大。

研究的目的在于探究進口大豆中麥角快速準確的鑒定方法，一種是利用質(zhì)譜法對疑似物所含的麥角生物堿衍生物如麥角胺、麥角新堿和麥角克堿等進行測定，來確定疑似物質(zhì)為麥角；另一種方法是分子生物學(xué)方法，提取核酸，利用PCR檢測，來確定是否為麥角菌。研究為病原菌的檢驗鑒定提供了一種新的思路，改變過去增菌、分離、鑒定的傳統(tǒng)模式，采用了質(zhì)譜法對病原菌產(chǎn)生的致病物質(zhì)進行分析，豐富了植物病原菌的檢驗鑒定理論。研究首次提出對麥角菌利用分子生物學(xué)原理進行鑒定，為麥角和菌核的區(qū)別鑒定提供了一個新的標準，為一線人員提供了鑒定基礎(chǔ)。

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A New Identification Method for Ergot of Imported Soybean

Li Linjie1,Li Xinzhou2,Xiao Zhongyu1,Yang Hongjuan1,Wang Kai1,Xu Meiling1
(1.Rizhao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Rizhao 276800,Shandong，China;2.Haiyang Municipal Ocean and Fisheries Administration,Haiyang 265100,Shandong，China)

The import of soybean in China is increasing year by year,and it is difficult to identify the ergot and sclerotium in the imported soybean.According to the toxic components of ergot,the main components are ergotamine,ergot alkaloids,ergometrine and other ingredients.Comparing the advantages and disadvantages of ergot alkaloids in the field of food detection methods,fast and effective detection methods were chosen.According to the present situation,three kinds of methods were proposed:one was the traditional sense of alkaloid color method,referenced GB 2715-2016quot;national food safety standards of foodquot;;the second detection method was liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,combined with detection method in the field of food of ergot alkaloids detection method,by using the steps of extraction,purification,composition analysis and other steps;the third was the method of molecular biology.The preparation and extraction of ergot nucleic acid were carried out,and then analyzed by common PCR instrument or fluorescent quantitative PCR.This study provided a new method for the detection and identification of pathogenic bacteria,and analyzed the pathogenic substances produced by pathogenic bacteria by liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,which enriched the theory of plant pathogen testing and identification.The molecular biology principle of ergot fungus was identified for the first time,which provided a new standard for identification of sclerotia and ergot in imported soybeans,providing an identification base for front-line personnel.

Sclerotium;Ergot alkaloid;Liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry;Ergot;Molecular biology;PCR

S565.1

A

1674-3547(2017)05-0029-05

2017-10-13

李林杰，助理工程師，主要從事進口大豆植物檢疫工作，E-mail:18206331636@126.com