董強 楊番 任英云 夏天保 尹萌萌 王澤錕 米霞 劉軍連 曹曉佳 劉建軍 葛蕓 梁龍 呂世超

100101北京，安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍第306臨床學(xué)院皮膚科（董強、夏天保、尹萌萌、王澤錕、米霞、劉軍連、曹曉佳、劉建軍、葛蕓、梁龍、呂世超）；天津市武清區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)療美容科（楊番）；佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院皮膚科（任英云）

成人跖疣人乳頭瘤病毒分型及與臨床特征的關(guān)系

董強 楊番 任英云 夏天保 尹萌萌 王澤錕 米霞 劉軍連 曹曉佳 劉建軍 葛蕓 梁龍 呂世超

100101北京，安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍第306臨床學(xué)院皮膚科（董強、夏天保、尹萌萌、王澤錕、米霞、劉軍連、曹曉佳、劉建軍、葛蕓、梁龍、呂世超）；天津市武清區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)療美容科（楊番）；佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院皮膚科（任英云）

目的 檢測成人跖疣乳頭瘤病毒（HPV）型別，并探討HPV分型與臨床特征的關(guān)系。方法 采用PCR擴增、基因測序和TA克隆技術(shù)檢測221例跖疣患者疣體的HPV型，記錄患者的年齡、病程、癥狀和疣體數(shù)。結(jié)果 221例標(biāo)本中，HPV陽性率為97%（215/221）。單一HPV型占96%（206/215），HPV 27、2、57和7（Alpha屬）分別占44.7%（92/206）、12.1%（25/206）、7.3%（15/206）和0.5%（1/206）；HPV 65（Gamma屬）占0.5%（1/206）；HPV 1、63（Mu屬）占33.5%（69/206）和1.5%（3/206）。HPV 27、2和57三型感染者之間年齡、病程、疣體個數(shù)、疼痛發(fā)生率和性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。與HPV 27感染者相比，HPV 1感染者與年齡≤30歲、病程≤1年、疣體數(shù)≤2個和疼痛高發(fā)生率相關(guān)。結(jié)論 HPV 27、2、57和1是感染成人跖疣患者的主要HPV型。HPV型與患者的臨床特征間存在相關(guān)性。

乳頭狀瘤病毒科；基因分型技術(shù)；疣；PCR；臨床特征；TA克隆

跖疣是由人乳頭瘤病毒（HPV）引起的常見皮膚病，可因疼痛影響行走或運動，治愈率低。研究發(fā)現(xiàn)，引起跖疣的主要HPV型是Alpha屬的2、27、57型，Mu屬的1型和Gamma屬的4、65型，分布可能存在地區(qū)差異［1-3］。HPV型和皮膚疣患者的臨床特征有關(guān)［2-4］，并可能和冷凍、水楊酸的療效及自然消退相關(guān)［5］。我們通過檢測成人跖疣患者的HPV型，探討HPV型分布及與臨床特征的關(guān)系。

一、對象與方法

（一）對象：

1.共入選221例≥18歲跖疣患者。97例是2013年3月至2015年3月參加我科ND：YAG長脈沖1 064 nm激光和冷凍治療跖疣隨機對照研究中隨機分配至冷凍治療組的受試者；124例是2015年9月至2016年5月在我院皮膚科門診就診的跖疣患者。其中男146例，女75例，平均年齡31（19～73）歲，平均病程1.33（0.01 ～11.25）年，平均疣體數(shù)5（1 ～ 20）個。本研究方法通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入選患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器：QIAamp DNA Mini Kit試劑盒（德國QIAgen公司），HPV L1區(qū)引物（北京華大基因公司），PCR擴增儀（ABI9700）、BDT V3.1試劑盒、測序儀（ABI3730XL）（美國ABI公司）。

（二）方法：

1.樣本采集：無菌手術(shù)刀刮取患者首發(fā)疣體或面積最大疣體表面皮屑，放入無菌樣品管中，低溫保存，待測HPV型［6］。

2.DNA提?。菏褂肣IAamp DNA Mini Kit試劑盒提取皮損標(biāo)本中的病毒DNA。除消化時間延長至12 h外，其余步驟按說明書進(jìn)行。

3.PCR擴增和電泳鑒定：用HPV L1區(qū)引物（正向引物5′-CARGGTCAYAAYAATGGYAT-3′，反向引物5′-AAYTTTC GTCCYARAGRAWATTGRTC-3′）和EX Taq擴增試劑擴增HPV的L1區(qū)基因。95℃變性5 min后進(jìn)行PCR循環(huán)（95℃1 min，52℃2 min，72℃1 min，40個循環(huán)），4℃保溫。凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，按磁珠純化試劑盒說明書純化擴增產(chǎn)物。

4.PCR產(chǎn)物測序和HPV分型：以純化后的擴增產(chǎn)物為模板，加入帶有不同熒光標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷酸，通過PCR反應(yīng)形成3′端帶有不同熒光標(biāo)記的不同長度的產(chǎn)物，擴增條件：96℃變性2 min；96℃ 10 s，55℃ 30 s，60℃ 3 min，共30個循環(huán)，16℃保溫。產(chǎn)物經(jīng)純化后通過測序儀自動測序，最后經(jīng)NCBI-BLAST數(shù)據(jù)庫比對確定HPV型。若測序峰圖是非單曲線，說明是多重感染，用TA Cloning技術(shù)確定HPV型。

5.多重感染的HPV型確定：純化產(chǎn)物與Peasy-T1載體連接后轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加500 μl SOC培養(yǎng)基，取200 μl培養(yǎng)液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)12 h，選5個白色菌落，95℃變性10 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃45 s，共30個循環(huán)，72℃延伸7 min。

（三）統(tǒng)計分析：用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析。多組及組間非正態(tài)分布計量資料比較用Kruskal-Wallis檢驗，兩組間比較用Mann-Whitney U檢驗；計數(shù)資料比較用χ2檢驗。

二、結(jié)果

1.一般情況：共檢出HPV陽性標(biāo)本215份（97%）。215例HPV陽性患者中，男142例（66.4%），女73例（33.6%）；18～25歲患者56例（26.0%），26～30歲69例（32.1%），31～40歲51例（23.7%），＞40歲39例（18.1%）。病程0～0.5年患者88例（40.9%），0.6～1年40例（18.6%），1.1～2年41例（19.1%），＞2年46例（21.4%）。有1個疣體患者62例（29.1%），2～5個疣體82例（38.5%），6～10個疣體35例（16.6%），＞10個疣體34例（16.4%）。62.3%（134/215）的患者有疼痛癥狀；至少有一個鑲嵌疣的患者占10.2%（22/215）。陰性標(biāo)本6例，2例患者僅有1個疣體，2例2～5個，2例6～10個。

2.HPV分型結(jié)果：單一HPV型（單HPV型）感染的患者占96.0%（206/215），檢出27、1、2、57、63、7和65共7個HPV型。多重感染的患者占4.0%（9/215），型別組合為HPV 1和27，HPV 1和2，HPV 2和27，HPV 1、2和27，分別為5例、2例、1例、1例。22例鑲嵌疣均為單HPV型感染，包括HPV 27、2、1、7、57、63，分別為11例、5例、3例、1例、1例、1例。各HPV型分布結(jié)果見表1。

表1 跖疣患者HPV型構(gòu)成比

3.HPV屬和型與患者臨床特征的關(guān)系：不同HPV屬和型感染患者的臨床特征見表2。Alpha屬HPV（27/2/57型）感染者中位年齡、病程、疣體個數(shù)均顯著高于Mu屬HPV（1/63型）感染者（U=3310.000、1521.500、3544.000，均P ＜0.01），疼痛發(fā)生率顯著低于Mu屬（χ2=37.777，P＜0.001），Alpha和Mu屬感染者性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.555，P=0.456）。HPV 27、2和57感染者之間中位年齡、病程、疣體個數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（H=1.335、0.324、3.389，均P＞0.05），疼痛發(fā)生率和性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.175、0.704，均P ＞ 0.05）。感染HPV 63的患者僅3例，未比較HPV 1和63患者的臨床特征。

將HPV 27和HPV1感染者的年齡、病程、疣體個數(shù)按年齡≤30歲、病程≤1年、疣體數(shù)≤2個二分類后，比較兩者臨床特征差異。結(jié)果顯示，除性別外，HPV 27感染者年齡≤30歲、病程≤1年、疣體數(shù)≤2個及疼痛的百分比均顯著低于HPV 1型感染者，見表3。

表2 不同屬或型HPV感染跖疣患者臨床特征比較

表3 HPV 27和1型跖疣患者臨床特征比較（例）

三、討論

本研究結(jié)果顯示，感染成人跖疣患者的主要HPV型 是 27、1、2 和 57，其中HPV 2/27/57型共占64.1%。Bruggink等［3］報道感染荷蘭跖疣患者（≥ 4歲）的主要HPV型也是 1、27、57和 2，其中 HPV 2、27、57占 59%，HPV 1占29%。de Planell-Mas等［7］發(fā)現(xiàn)感染西班牙跖疣患者（≥ 4歲）的主要 HPV 型同樣是57、27、1和2，其中HPV 2/27/57占76.1%，HPV 1占20.9%。以上結(jié)果說明，HPV2/27/57和HPV1可能是感染歐亞成人跖疣的主要HPV型，亞洲HPV 1的比例可能高于歐洲。

有報道，HPV型與患者臨床特征相關(guān)，如HPV 1易感染年輕人［2-4］并和跖疣相關(guān)［1，5］，感染HPV 1的患者疣體數(shù)少、病程短［2-3］。本研究發(fā)現(xiàn)，與感染Alpha屬HPV的患者相比，感染Mu屬患者的年齡更小、病程更短、疣體個數(shù)更少，且疼痛發(fā)生率更高。將患者臨床數(shù)據(jù)兩分類后分析發(fā)現(xiàn)，感染HPV 1的成人跖疣患者具有年齡≤30歲、病程≤1年、疣體數(shù)≤2個及疼痛發(fā)生率高的臨床特征，而感染HPV 27的患者相反。我們認(rèn)為，HPV 1和27感染者疼痛發(fā)生率的差異可能導(dǎo)致病程和疣體數(shù)差異，所以疼痛可能是重要的臨床特征；疼痛發(fā)生率的差異可能由不同屬HPV型生物學(xué)特性決定。本文結(jié)果顯示，HPV多重感染率為4.0%，HPV 1、27和2占比最多，提示多重感染的主要HPV型和單型感染基本一致。22例鑲嵌疣均為單HPV型感染，HPV 2/7/27/57占81.7%，HPV 1/63占18.1%，提示Alpha的HPV型可能更易引起鑲嵌疣。

志謝 北京大學(xué)生育健康研究所周玉博博士，北京奧康華醫(yī)學(xué)檢驗所王燕飛檢驗師

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Relationship between human papillomavirus genotypes in and clinical characteristics of adult plantar warts

Dong Qiang,Yang Fan,Ren Yingyun,Xia Tianbao,Yin Mengmeng,Wang Zekun,Mi Xia,Liu Junlian,Cao Xiaojia,Liu Jianjun,Ge Yun,Liang Long,Lyu Shichao
Department of Dermatology,306th Clinical College of People′s Liberation Army,Anhui Medical University,Beijing 100101,China（Dong Q,Xia TB,Yin MM,Wang ZK,Mi X,Liu JL,Cao XJ,Liu JJ,Ge Y,Liang L,Lyu SC）;Department of Medical Cosmetology,The People′s Hospital of Wu Qing,Tianjin 301700,China（Yang F）;Department of Dermatology,The Third People′s Hospital,Nanhai District,Foshan City,Foshan 528200,Guangdong,China（Ren YY）

Lyu Shichao,Email:lvshichao@sina.com

Objective To investigate human papillomavirus（HPV）genotypes in adult patients with plantar warts,and to explore their relationship with clinical features of adult plantar warts.Methods PCR,gene sequencing and TA-cloning technique were performed to detect HPV types in 221 patients with plantar warts.Meanwhile,clinical data were recorded,including patients′age,disease duration,symptoms and number of warts.Results Of 221 specimens,HPV DNA was detected in 215,with the HPV-positive rate being 97%.Single HPV infections were detected in 206 specimens（96%,206/215）,among which,HPV types included HPV-27（44.7%,92/206）,-2（12.1%,25/206）,-57（7.3%,15/206）,-7（Alpha genus;0.5%,1/206）,-65（Gamma genus;0.5%,1/206）,-1（33.5%,69/206）and-63（Mu genus;1.5%,3/206）.There were no significant differences in age,disease duration,number of warts,incidence of pain and gender among patients with HPV-27,-2 or-57 infections.Compared with patients with HPV-27 infection,patients with HPV-1 infection were more related to age≤30 years,disease duration≤1 year,number of warts≤2 and high incidence of pain.Conclusion HPV-27,-2,-57 and-1 are the main types in adult patients with plantar warts,and HPV types are correlated with clinical features of adult plantar warts.

Papillomaviridae;Genotyping techniques;Warts;PCR;Clinical features;TA cloning

呂世超，Email：lvshichao@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.013

首都臨床特色應(yīng)用研究（Z141107002514179）

Fund program:Capital Clinical Characteristic Application Research（Z141107002514179）

2016-12-01）

（本文編輯：尚淑賢）