劉影 張婷 趙光明 倪靜 王宇鵬 劉越堅(jiān) 宋智琦

116011大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（劉影、張婷、趙光明、倪靜、王宇鵬、宋智琦），中心實(shí)驗(yàn)室（劉越堅(jiān)）

紫外線對(duì)HaCaT細(xì)胞中瞬時(shí)受體電位錨蛋白1的影響

劉影 張婷 趙光明 倪靜 王宇鵬 劉越堅(jiān) 宋智琦

116011大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科（劉影、張婷、趙光明、倪靜、王宇鵬、宋智琦），中心實(shí)驗(yàn)室（劉越堅(jiān)）

目的 探討HaCaT細(xì)胞中瞬時(shí)受體電位錨蛋白1（TRPA1）的光控作用及其機(jī)制。方法 培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞分為225 mJ/cm2UVA刺激組和25 mJ/cm2UVB刺激組，UVA刺激組分為空白對(duì)照組（僅有HaCaT細(xì)胞）、視黃醛組、UVA組、視黃醛+UVA組（UVA-TRPA1對(duì)照組）、視黃醛+UVA+肉桂醛組（UVA-TRPA1激動(dòng)組）、視黃醛+UVA+樟腦組（UVA-TRPA1抑制組）；UVB刺激組分為空白對(duì)照組（僅有HaCaT細(xì)胞）、視黃醛組、UVB組、視黃醛+UVB組（UVB-TRPA1對(duì)照組）、視黃醛+UVB+肉桂醛組（UVB-TRPA1激動(dòng)組）、視黃醛+UVB+樟腦組（UVB-TRPA1抑制組）。qPCR、Western印跡檢測(cè)HaCaT細(xì)胞中TRPA1的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組HaCaT細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的變化。結(jié)果 qPCR和Western印跡顯示，HaCaT細(xì)胞中有TRPA1 mRNA及蛋白的表達(dá)。UVA作用后空白對(duì)照組、視黃醛組、UVA組、視黃醛+UVA組熒光強(qiáng)度分別為155.06±7.62、148.37±18.77、166.92±3.71、331.333±40.563，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.509，P＜0.01）。UVB作用后空白對(duì)照組、視黃醛組、UVB組、視黃醛+UVB組熒光強(qiáng)度分別為150.20±1.73、171.66±56.23、147.56±6.60、250.44±9.13，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=85.261，P＜0.01），視黃醛+UVA/UVB組熒光強(qiáng)度均高于空白對(duì)照組（q值分別為18.442、6.052，P＜0.01）。TRPA1激動(dòng)劑和拮抗劑可調(diào)節(jié)UVA、UVB所引起的鈣離子內(nèi)流的變化（P＜0.001），在UVA、UVB作用下，TRPA1激動(dòng)劑組熒光強(qiáng)度均高于對(duì)照組（q值分別為14.934、32.770，P ＜ 0.001），TRPA1抑制劑組熒光強(qiáng)度均低于對(duì)照組（q值分別為7.986、14.596，P ＜0.001）。結(jié)論 TRPA1在皮膚HaCaT細(xì)胞中有表達(dá)，UVA或UVB可通過TRPA1調(diào)控HaCaT細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流。

角蛋白細(xì)胞；紫外線；瞬時(shí)受體電位通道；錨蛋白類；HaCaT細(xì)胞

瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道是位于真核細(xì)胞膜上的一類重要的非選擇性陽離子通道，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅的視覺系統(tǒng)，突變體果蠅對(duì)持續(xù)的光刺激產(chǎn)生瞬時(shí)而非持續(xù)的峰電位［1］。大多數(shù)TRP通道為鈉離子、鈣離子等滲透型通道，其中瞬時(shí)受體電位錨蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）為鈣離子滲透型通道。Bellono等［2-3］提出TRPA1可能是唯一的眼外光轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，表皮黑素細(xì)胞受到紫外線輻射時(shí)，Gα/q11蛋白-磷脂酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，隨后激活TRPA1通道使大量的鈣離子內(nèi)流，從而導(dǎo)致早期黑素合成增加。為了進(jìn)一步探討TRPA1在角質(zhì)形成細(xì)胞中的光控作用，我們研究了在長(zhǎng)波紫外線（UVA）、中波紫外線（UVB）作用下，HaCaT細(xì)胞中視黃醛依賴性鈣離子內(nèi)流的情況以及TRPA1通道抑制及激活狀態(tài)下對(duì)HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子內(nèi)流的影響。

材料和方法

一、材料

DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Corning公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%青霉素-鏈霉素及含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、視黃醛、TRPA1通道激動(dòng)劑-肉桂醛、TRPA1通道拮抗劑-樟腦（美國(guó)Sigma公司）?？俁NA提取試劑（Trizol）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTMRT reagent Kit）、熒光定量試劑盒（SYBR?Premix ExTaq?Ⅱ）及qPCR引物設(shè)計(jì)（大連寶生物工程有限公司）。qPCR引物設(shè)計(jì)（大連寶生物工程有限公司）；兔抗人TRPA1多克隆抗體（中國(guó)臺(tái)灣Abnova公司），兔抗人β肌動(dòng)蛋白多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京博奧生物集團(tuán)有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Fluo-3AM鈣離子熒光探針（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；HaCaT細(xì)胞株（廣州賽庫生物技術(shù)有限公司）、人胚腎293T細(xì)胞（HEK293T細(xì)胞株，美國(guó)ATCC細(xì)胞庫）均為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞用含15%FBS和DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞并傳代。HEK293T細(xì)胞用含10%FBS和DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度融合至70%～80%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞并傳代。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。HaCaT細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，HEK293T細(xì)胞為陽性對(duì)照組。

2.細(xì)胞分組：視黃醛溶于無水乙醇中，終濃度為12 μmol/L，肉桂醛、樟腦分別溶于DMSO中，終濃度分別為500 μmol/L和1 mmol/L，在實(shí)驗(yàn)前混合到細(xì)胞外溶液中（最終DMSO濃度＜1‰）。實(shí)驗(yàn)分為225 mJ/cm2UVA刺激組和25 mJ/cm2UVB刺激組，UVA刺激組分為空白對(duì)照組（僅有HaCaT細(xì)胞）、視黃醛組、UVA組、視黃醛+UVA組（UVA-TRPA1對(duì)照組）、視黃醛+UVA+肉桂醛組（UVA-TRPA1激動(dòng)組）、視黃醛+UVA+樟腦組（UVA-TRPA1抑制組）；UVB刺激組分為空白對(duì)照組（僅有HaCaT細(xì)胞）、視黃醛組、UVB組、視黃醛+UVB組（UVBTRPA1對(duì)照組）、視黃醛+UVB+肉桂醛組（UVBTRPA1激動(dòng)組）、視黃醛+UVB+樟腦組（UVBTRPA1抑制組）。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)TRPA1基因表達(dá)：采用Trizol試劑提取實(shí)驗(yàn)組HaCaT細(xì)胞及陽性對(duì)照組HEK293T細(xì)胞總RNA，紫外/可見光分光光度儀檢測(cè)總RNA的純度及濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用熒光定量試劑盒進(jìn)行目的基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增。目的基因TRPA1正向引物：5′-TTCCTGGAAAGCTTCATGTTGAAAG-3′，反向引物：5′-TCAAAGTGACATCAGGTGTGTTGG-3′，擴(kuò)增片段為120 bp；內(nèi)參基因GAPDH正向引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴(kuò)增片段為138 bp。PCR反應(yīng)體系為20 μl，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95℃30 s，PCR反應(yīng)為95℃5 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。

4.Western印跡法檢測(cè)TRPA1蛋白表達(dá)：收集HaCaT細(xì)胞及HEK293T細(xì)胞，適量RIPA裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，上樣20 μg電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，給予一抗（兔抗人TRPA1多克隆抗體及兔抗人β肌動(dòng)蛋白多克隆抗體濃度均為1∶1 500）4℃過夜，二抗（山羊抗兔IgG抗體濃度1∶3 000）室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，目的蛋白條帶TRPA1與β肌動(dòng)蛋白條帶的灰度值比值作為蛋白表達(dá)的半定量指標(biāo)。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)HaCaT細(xì)胞內(nèi)鈣離子：根據(jù)UVA、UVB刺激進(jìn)行細(xì)胞分組處理，培養(yǎng)24 h，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，棄上清。隨后，加入500 μl正常生理緩沖液［NPB，為正常生理溶液（NPS，120 mmol/L NaCl、3.3mmol/LKCl、1.2mmol/LKH2PO4、0.8mmol/LMgSO4、24 mmol/L NaHCO3）中加 入1.0 m mol/L CaCl2和 0.1%BSA（重量/體積）］重懸細(xì)胞；室溫下加入Fluo-3AM（終濃度5 mmol/L）及視黃醛、肉桂醛、樟腦，給予UVA/UVB照射，室溫下孵育45 min。然后179×g，離心10min，棄上清，用500 μl NPS洗滌細(xì)胞沉淀2次，最后加入500 μl NPS重懸。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度（鈣離子濃度的相對(duì)含量），激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示。兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），采用q檢驗(yàn)、LSD法進(jìn)行組間多重比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TRPA1在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)

HaCaT細(xì)胞及HEK293T細(xì)胞中TRPA1 mRNA的表達(dá)量分別為0.31±0.09、0.93±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.262，P ＜0.001）。HaCaT細(xì)胞及HEK293T細(xì)胞中TRPA1/β肌動(dòng)蛋白條帶的灰度比分別為0.27±0.08、0.49±0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.701，P＜0.05）。見圖1。

圖1 Westren印跡法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞及HEK293T細(xì)胞內(nèi)源性瞬時(shí)受體電位錨蛋白1（TRPA1）的表達(dá) TRPA1 Westren印跡電泳圖。1：HaCaT；2：HEK293T

二、紫外線照射對(duì)HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子內(nèi)流的影響

1.UVA照射：UVA增加HaCaT細(xì)胞中視黃醛依賴性的鈣離子內(nèi)流，空白對(duì)照組、視黃醛組、UVA組、視黃醛+UVA組間熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.509，P＜0.01），見表1。與空白對(duì)照組相比，視黃醛組、UVA組鈣離子內(nèi)流沒有增加（q值分別為0.780、1.382，P ＞ 0.05），視黃醛 +UVA組鈣離子內(nèi)流顯著增加（q=18.442，P＜0.01）。

表1 UVA、UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子內(nèi)流的影響

2.UVB照射：UVB增加HaCaT細(xì)胞中視黃醛依賴性的鈣離子內(nèi)流，空白對(duì)照組、視黃醛組、UVB組、視黃醛+UVB組間熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=85.261，P＜0.01）。見表1。與空白對(duì)照組相比，視黃醛組、UVB組未見鈣離子的增加（q值分別為1.295、-0.160，P ＞ 0.05），視黃醛 +UVB組鈣離子內(nèi)流顯著增加（q=6.052，P＜0.01）。

三、TRPA1的激活與抑制對(duì)紫外線照射介導(dǎo)HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子內(nèi)流的調(diào)節(jié)

1.UVA照射：TRPA1激活UVA介導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性的鈣離子內(nèi)流，對(duì)照組、視黃醛+UVA+肉桂醛組、視黃醛+UVA+樟腦組間熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=136.229，P＜0.01）。與對(duì)照組相比，視黃醛+UVA+肉桂醛組鈣離子內(nèi)流顯著增加（q=14.934，P＜0.001），視黃醛 +UVA+樟腦組鈣離子內(nèi)流顯著減少（q=7.986，P＜0.001）。見表2，圖2。

表2 TRPA1調(diào)節(jié)UVA、UVB介導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子的內(nèi)流（熒光強(qiáng)度，±s）

表2 TRPA1調(diào)節(jié)UVA、UVB介導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子的內(nèi)流（熒光強(qiáng)度，±s）

注：n≥3

圖2 TRPA1調(diào)節(jié)UVA介導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子的內(nèi)流（M1數(shù)值為相對(duì)熒光強(qiáng)度）

2.UVB照射：TRPA1激活UVB介導(dǎo)的視黃醛依賴性HaCaT細(xì)胞的鈣離子內(nèi)流，視黃醛+UVB組、視黃醛+UVB+肉桂醛組、視黃醛+UVB+樟腦組間熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=639.058，P＜0.01）。見表2，圖3。與對(duì)照組相比，視黃醛+UVB+肉桂醛組鈣離子內(nèi)流顯著增加（q=32.770，P＜0.001），視黃醛+UVB+樟腦組鈣離子內(nèi)流顯著減少（q=14.596，P ＜ 0.001）。

圖3 TRPA1調(diào)節(jié)UVB介導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子的內(nèi)流（M1數(shù)值為相對(duì)熒光強(qiáng)度）

討 論

TRPA1最初被認(rèn)為是機(jī)械性刺激的感受器，受到如物理刺激（溫度、機(jī)械力等）、化學(xué)刺激（pH值、信息素等）等不同機(jī)制的激活和調(diào)控［4］。近期研究發(fā)現(xiàn)，TRPA1通路是目前唯一的眼外光轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可被紫外線所激活［2-3］。因此，TRPA1在皮膚光生物學(xué)方面可能發(fā)揮作用。

鈣離子作為胞內(nèi)第二信使，在細(xì)胞生命活動(dòng)中起著重要的作用，如參與遞質(zhì)和激素的合成與釋放［5］、促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞間黏附等［6-7］。本研究結(jié)果表明，UVA及UVB均可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子內(nèi)流；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，激活或者抑制TRPA1通道能夠顯著增加或減少UVA、UVB介導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞視黃醛依賴性鈣離子內(nèi)流。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異蛋白65（RPE65）由Hamel等［8］于1993年發(fā)現(xiàn)，定位于染色體lp31，是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞大量特異性表達(dá)、高度保守的蛋白序列，后于2005年由Redmond等［9］證實(shí)為視黃醇異構(gòu)酶。RPE65是視網(wǎng)膜內(nèi)維生素A循環(huán)又稱視循環(huán)的重要結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是催化全反式視黃酯轉(zhuǎn)變成11-順-視黃醇的異構(gòu)酶之一，后者再經(jīng)過一系列代謝轉(zhuǎn)變成視紫紅質(zhì)，參與視覺系統(tǒng)中光信號(hào)的傳導(dǎo)過程［10-11］。有研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞中亦有RPE65的表達(dá)［12］。由此我們推測(cè)在HaCaT細(xì)胞中，紫外線所引起鈣離子內(nèi)流顯著增加的效應(yīng)與哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中視循環(huán)相類似：可能是通過RPE65催化全反式視黃酯向順式視黃醇的反應(yīng)，從而參與表皮細(xì)胞的光控作用。因此TRPA1的光通道作用機(jī)制可能是紫外線照射與視黃醛共孵育的HaCaT細(xì)胞后，使TRPA1離子通道開放，細(xì)胞內(nèi)鈣離子顯著增加，從而激活鈣離子觸發(fā)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

綜上所述，紫外線激活TRPA1通道導(dǎo)致黑素細(xì)胞早期黑素合成增加的效應(yīng)與引起角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)鈣離子顯著增加的效應(yīng)均體現(xiàn)表皮細(xì)胞中紫外線與TRPA1之間的密切聯(lián)系，從而我們認(rèn)為，TRPA1在角質(zhì)形成細(xì)胞中具有光控作用。

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Effect of ultraviolet radiation on expression of transient receptor potential ankyrin 1 in HaCaT cells

Liu Ying,Zhang Ting,Zhao Guangming,Ni Jing,Wang Yupeng,Liu Yuejian,Song Zhiqi
Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China（Liu Y,Zhang T,Zhao GM,Ni J,Wang YP,Song ZQ）;Central Laboratory,The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China（Liu YJ）

Song Zhiqi,Email:szqdalian@163.com

Objective To investigate the photoregulation of transient receptor potential ankyrin 1（TRPA1）in HaCaT cells,and to explore its mechanisms.Methods Cultured HaCaT cells were divided into 225-mJ/cm2UVA radiation groups and 25-mJ/cm2UVB radiation groups.HaCaT cells in the UVA radiation groups were further classified into 6 groups:blank control group 1 receiving no treatment,retinal group 1 treated with 12 μmol/L retinal alone,UVA group treated with 225 mJ/cm2UVA radiation alone,retinal+UVA group（UVA-TRPA1 control group）,retinal+UVA+500 μmol/L cinnamaldehyde group（UVA-TRPA1 agonist group）and retinal+UVA+1 mmol/L camphor group（UVA-TRPA1 antagonist group）.Additionally,HaCaT cells in the UVB radiation groups were also further classified into 6 groups:blank control group 2 receiving no treatment,retinal group 2 treated with 12 μmol/L retinal alone,UVB group treated with 25-mJ/cm2UVB radiation,retinal+UVB group（UVB-TRPA1 control group）,retinal+UVB+500 μmol/L cinnamaldehyde group（UVB-TRPA1 agonist group）and retinal+UVB+1 mmol/L camphor group（UVB-TRPA1 antagonist group）.Real-time fluorescence-based quantitative PCR（qPCR）and Western blot analysis were performed to determine the mRNA and protein expression of TRPA1 respectively.Flow cytometry was conducted to investigate changes of calcium influx in HaCaT cells in the above groups.Results qPCR and Western blot analysis showed that TRPA1 mRNA and protein were expressed in HaCaT cells.The fluorescence intensity of calcium influx significantly differed among the blank control group 1,retinal group 1,UVA group and retinal+UVA group（155.06±7.62,148.37±18.77,166.92±3.71 and 331.333±40.563;F=44.509,P＜0.01）,as well as among the blank control group 2,retinal group 2,UVB group and retinal+UVB group（150.20±1.73,171.66±56.23,147.56±6.60 and 250.44 ± 9.13;F=85.261,P ＜ 0.01）.Additionally,retinal+UVA/UVB groups showed significantly higher fluorescence intensity of calcium influx compared with the blank control groups（q=18.442,6.052,P ＜ 0.01）.The TRPA1 agonist cinnamaldehyde and its antagonist camphor could regulate the UVA-and UVB-induced calcium influx（P ＜ 0.001）.Compared with the blank control group 1 and 2 respectively,the fluorescence intensity of retinal-dependent calcium influx was significantly higher in the UVA/UVB-TRPA1 agonist group（q=14.934,32.770,P ＜ 0.001）,and significantly lower in the UVA/UVBTRPA1 antagonist group（q=7.986,14.596,P ＜ 0.001）.Conclusion TRPA1 is expressed in HaCaT cells,and UVA or UVB can regulate the calcium influx in HaCaT cells by adjusting the activity of TRPA1.

Keratinocytes;Ultraviolet rays;Transient receptor potential channels;Ankyrins;HaCaT cells

宋智琦，Email：szqdalian@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472865）；遼寧省自然科學(xué)基金（2014023005）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81472865）;Natural Science Foundation of Liaoning Province of China（2014023005）

2016-12-09）

（本文編輯：朱思維 顏艷）