夏永華 侯慧芳 李敏 張彩鳳 劉冬 胡華 張孟杰 程賽

453100河南衛(wèi)輝，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科（夏永華、李敏、劉冬、胡華、張孟杰、程賽），消化內(nèi)科（張彩鳳）；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室（侯慧芳）

MiRNA-373在皮膚鱗狀細胞癌的表達及對侵襲的影響

夏永華 侯慧芳 李敏 張彩鳳 劉冬 胡華 張孟杰 程賽

453100河南衛(wèi)輝，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚科（夏永華、李敏、劉冬、胡華、張孟杰、程賽），消化內(nèi)科（張彩鳳）；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室（侯慧芳）

目的 分析microRNA-373（miR-373）在皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）組織和細胞中的表達，探討對皮膚鱗癌細胞侵襲的影響。方法 實時PCR檢測皮膚鱗癌組織和細胞中miR-373的表達，將miR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA轉(zhuǎn)染皮膚鱗癌A431細胞，采用細胞侵襲實驗分析miR-373表達下調(diào)對細胞侵襲的影響，采用Western印跡分析miR-373表達下調(diào)對MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響。結(jié)果 皮膚鱗癌組織（2.465±0.218）和SCL-1細胞及A431細胞（1.864±0.178，2.919±0.277）中miR-373的表達水平顯著高于瘤旁組織和細胞（1.000±0.000），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在轉(zhuǎn)移性的皮膚鱗癌患者（3.323±0.344）中，miR-373的表達顯著高于非轉(zhuǎn)移組（1.914±0.161），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.158，P＜0.01）。與未處理組和陰性對照組相比，miR-373模擬物顯著增加皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平和細胞的侵襲能力，而miR-373的抑制劑顯著下調(diào)皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平和細胞的侵襲，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論 MiR-373表達下調(diào)顯著抑制皮膚鱗癌A431細胞的侵襲，并能顯著下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白的表達。

腫瘤，鱗狀細胞；皮膚；微RNAs；腫瘤轉(zhuǎn)移；microRNA-373

MiRNAs（miRNA）最初鑒定為一類短的單鏈小分子RNA［1］，能調(diào)控許多靶基因的表達參與多種細胞生物學(xué)過程的調(diào)控［2-3］。由于miRNA具有重要的生物學(xué)功能，因此，異常miRNA的表達涉及人類疾病的發(fā)病機制，特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］。近來，研究集中在miR-373與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究上，包括食道鱗狀細胞癌（鱗癌）［5］、宮頸癌［6］、非小細胞肺癌［7］、胃癌［8］等。因此，我們用實時 PCR檢測皮膚鱗癌組織和細胞中miR-373的表達，并分析其表達下調(diào)對皮膚鱗癌侵襲的影響，旨在為以miR-373為靶點的皮膚鱗癌的分子靶向治療提供依據(jù)。

資料與方法

一、組織標(biāo)本和細胞株

23例皮膚鱗癌組織和23例瘤旁組織均取自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院頭面部皮膚外科手術(shù)切除標(biāo)本，直徑0.5～3 cm，鱗癌標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)診斷為皮膚鱗癌?；颊咝g(shù)前均未接受放療、化療和免疫治療等。皮膚鱗癌中男15例，女8例；年齡41～75歲，年齡（55.6±8.67）歲；23例中鱗癌Ⅰ級14例，Ⅱ級8例，Ⅲ級1例；9例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。對照組為外科手術(shù)切緣瘤旁組織。皮膚鱗癌細胞株（SCL-1）由德國柏林自由大學(xué)本杰明·富蘭克林醫(yī)學(xué)中心惠贈，皮膚鱗癌細胞株（A431）購于美國ATCC公司，HaCaT細胞購于德國CLS中心。本研究通過新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

二、實驗材料

MiR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA從上海吉瑪公司購買；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司；胎牛血清購于美國Gibco公司；實時PCR試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；蛋白裂解液購于寶生物工程（大連）有限公司；鼠抗人單克隆抗體基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2和MMP-9購于美國Santa Cruz公司。

三、細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

SCL-1、A431和HaCaT細胞均培養(yǎng)在含10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，將上述細胞置于37℃，5%CO2相對飽和的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，上述實驗細胞處于對數(shù)生長期。將MiR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA分別轉(zhuǎn)染皮膚鱗癌A431細胞中，于48 h進行實驗。實驗分組：未處理組（A431細胞不進行任何處理）、陰性對照組、miR-373模擬物組和miR-373抑制劑組。

四、實時PCR檢測組織和細胞中miR-373的表達

按照Trizol試劑說明書，提取組織和細胞的總RNA，利用miR-373和U6反轉(zhuǎn)錄引物。miR-373 RT引物：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGG CAATTGCACTGGATACGACACACCC-3′，U6 RT 引物 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG CACTGGATACGACAAAATA-3′，均由吉凱生物公司合成）按操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，采用實時PCR試劑盒的說明書分別擴增細胞中miR-373基因，并用U6基因作為內(nèi)參照。hsa-miR-373-3p正向引物：5′-GGGAAGTGCTTCGATTTTG-3′，反 向 引 物 ：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6 正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。MiR-373的相對表達量用2-△△Ct計算［9］。

五、細胞侵襲實驗

將miR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA轉(zhuǎn)染皮膚鱗癌A431細胞中，將基底膜基質(zhì)原液置于4℃冰箱過夜融化，將基底膜基質(zhì)原液和預(yù)冷的無血清DMEM按照1∶3的比例配制侵襲小室的上室凝膠液，每孔50 μl包被侵襲小室的上室，放置37℃孵育箱孵育2 h使其成膠。Transwell小室上室每孔接種200 μl不含血清細胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基500 μl。 將Transwell板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用結(jié)晶紫染色。通過顯微鏡觀察被染色細胞，并進行計數(shù)。實驗重復(fù)3次取均值。

六、Western印跡檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達

將miR-373模擬物、miR-373抑制劑以及陰性對照miRNA轉(zhuǎn)染皮膚鱗癌A431細胞后48 h，收集4組不同處理的A431細胞，采用細胞裂解液提取總蛋白，進行SDS-PAGE電泳，并將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉NC膜2 h，加入一抗（MMP-2、MMP-9和β肌動蛋白）1∶200，于4℃搖床孵育過夜。加入二抗室溫孵育2 h。將NC膜置于ECL（增強化學(xué)發(fā)光試劑）中反應(yīng)1～3 min，于暗室中曝光，并通過顯影和定影進而顯示特異的蛋白信號。蛋白表達的灰度值用Image-Pro Plus5.0軟件進行分析，蛋白相對表達為目的基因與內(nèi)參基因的比值，β肌動蛋白作為內(nèi)參照。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、MiR-373在皮膚鱗癌組織中的表達

皮膚鱗癌組織中miR-373的表達水平（2.465±0.218）顯著高于瘤旁組織（1.000±0.000），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.713，P＜0.01）。轉(zhuǎn)移組（9例）和非轉(zhuǎn)移組（14例）中miR-373的表達，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的皮膚鱗癌組織中miR-373的表達水平（3.323±0.344）顯著高于非轉(zhuǎn)移組（1.914±0.161），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.158，P=0.0004）。見表1。

表1 miR-373在瘤旁組織和皮膚鱗狀細胞癌組織中的表達

二、MiR-373在皮膚鱗癌細胞中的表達

2株皮膚鱗癌細胞株中miR-373的表達水平顯著高于HaCaT細胞miR-373的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平也顯著高于另一株皮膚鱗癌SCL-1細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。miR-373模擬物、抑制劑以及陰性對照用來轉(zhuǎn)染A431細胞，轉(zhuǎn)染后48 h采用實時PCR檢測不同組別的細胞中miR-373的表達結(jié)果表明，與未處理組和陰性對照組相比，miR-373模擬物顯著增加皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平，而miR-373的抑制劑顯著下調(diào)皮膚鱗癌A431細胞中miR-373的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 MiR-373在不同皮膚細胞系及各組不同處理A431細胞的中的相對表達水平

三、MiR-373表達下調(diào)顯著抑制A431細胞的侵襲能力

用Transwell小室分析miR-373表達下調(diào)對皮膚鱗癌A431細胞侵襲能力的影響，與未處理組和陰性對照組相比，miR-373的過表達顯著增加A431細胞的侵襲能力，而抑制miR-373的表達顯著降低A431細胞的侵襲能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 MiR-373表達水平的變化對皮膚鱗癌A431細胞侵襲細胞數(shù)的影響

圖1 Western印跡檢測不同處理組皮膚鱗狀細胞癌A431細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達 1：未處理組；2：陰性對照組；3：miR-373模擬物；4：miR-373抑制劑

四、MiR-373表達下調(diào)對MMP-2和MMP-9表達的影響

與未處理組和陰性對照組相比，miR-373的過表達顯著增加MMP-2和MMP-9蛋白的表達，而miR-373表達下調(diào)顯著抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達（圖1）。

討 論

研究表明，miR-373參與細胞增殖、凋亡、衰老、中內(nèi)胚層分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)調(diào)控作用。在一些腫瘤中，miR-373發(fā)揮癌基因的功能，而在另一些腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的功能，包括：膽管癌［10］、結(jié)腸癌［11］、胰腺癌［12］，miR-373的過表達顯著抑制腫瘤的生長和增殖?？梢酝茰ymiR-373在不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有不同的功能，可能與腫瘤的類型密切相關(guān)，因而闡明不同腫瘤中miR-373的表達模式，可能為腫瘤的早期診斷和靶向治療奠定基礎(chǔ)。本研究采用實時PCR檢測23例皮膚鱗癌組織和對應(yīng)的瘤旁組織中miR-373的表達，結(jié)果顯示，皮膚鱗癌中miR-373的表達水平顯著高于瘤旁組織，最為重要的是，miR-373在轉(zhuǎn)移性的皮膚鱗癌患者中的表達水平顯著高于非轉(zhuǎn)移的皮膚鱗癌患者，提示miR-373在皮膚鱗癌中發(fā)揮癌基因的功能，可能成為皮膚鱗癌患者轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)之一。

最近研究表明，miRNAs是細胞遷移和侵襲的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子［13］，許多miRNAs有望開發(fā)成為腫瘤轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子。Zhao等［14］研究表明，miR-4775被鑒定為結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的高風(fēng)險因子，在對544個結(jié)腸癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-4775的高表達預(yù)示患者預(yù)后不佳。闡明miRNAs在腫瘤中侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其詳細的分子機制有望為以miRNAs的腫瘤分子靶向治療提供實驗證據(jù)。miR-373首次在乳腺癌中被鑒定為促轉(zhuǎn)移miRNA，采用正向基因篩選技術(shù)，Huang等［15］用miRNA表達文庫轉(zhuǎn)導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞，通過transwell細胞遷移分析其細胞遷移能力，從而鑒定miR-373作為促轉(zhuǎn)移miRNA分子。最近研究顯示，miR-373的過表達顯著增強Eca109細胞的增殖，促進該細胞的遷移和侵襲，相關(guān)抑制miR-373的表達顯著降低KYSE410細胞的增殖，并抑制該細胞的遷移和侵襲，這與TIMP3的表達密切相關(guān)［5］。為了證實miR-373在皮膚鱗癌遷移和侵襲中的作用，我們發(fā)現(xiàn)miR-373表達下調(diào)顯著抑制皮膚鱗癌細胞的遷移和侵襲，進一步發(fā)現(xiàn)miR-373表達下調(diào)能抑制MMP-2和MMP-9的表達，提示miR-373可能在皮膚鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，后續(xù)尚需進一步證實其調(diào)控皮膚鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移的詳細的分子機制。

綜上所述，miR-373在皮膚鱗癌組織和細胞中高表達，其表達下調(diào)顯著抑制皮膚鱗癌細胞的遷移和侵襲能力，可能與MMP-2和MMP-9表達下調(diào)密切相關(guān)，因而可能成為皮膚鱗癌潛在的新的治療靶點。

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Expression of microRNA-373 in cutaneous squamous cell carcinoma and its effect on cell invasion

Xia Yonghua,Hou Huifang,Li Min,Zhang Caifeng,Liu Dong,Hu Hua,Zhang Mengjie,Cheng Sai
Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Weihui 453100,Henan,China（Xia YH,Li M,Liu D,Hu H,Zhang MJ,Cheng S）;Department of Gastroenterology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Weihui 453100,Henan,China（Zhang CF）;Department of Pathophysiology,School of Basic Medical Sciences,Xinxiang Medical University,Weihui 453100,Henan,China（Hou HF）

Xia Yonghua,Email:751195651@qq.com

Objective To investigate the expression of microRNA-373（miR-373）in cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）tissues and cells,and to explore its effects on cell invasion.Methods Real-time PCR was performed to determine the expression of miR-373 in CSCC tissues and paralesional normal skin tissues,as well as in CSCC cell lines（A431 and SCL-1）and HaCaT cells.A431 cells were divided into 4 groups:miR-373 mimic group,miR-373 inhibitor group and negative control group which were transfected with miR-373 mimic,miR-373 inhibitor and negative control miRNA respectively,and untreated group receiving no treatment.Cell invasion assay was performed to evaluate effects of miR-373 downregulation on cell invasion.Western blot analysis was conducted to assess effects of miR-373 downregulation on the protein expression of matrix metalloproteinase-2（MMP-2）and MMP-9.Results Expression of miR-373 was significantly higher in the CSCC tissues（2.465 ± 0.218） than in the paralesional normal skin tissues（1.000 ± 0.000,P ＜ 0.05）,and higher in SCL-1 cells（1.864 ± 0.178）and A431 cells（2.919 ± 0.277）than in HaCaT cells（1.000 ± 0.000,P ＜ 0.05）.Most notably,miR-373 expression was also markedly higher in metastatic CSCC tissues than in non-metastatic CSCC tissues（3.323 ±0.344 vs.1.914 ± 0.161,t=4.158,P=0.000 4）.Compared with the untreated group and negative control group,the miR-373 mimic group showed significantly increased miR-373 expression and invasive ability,while the miR-373 inhibitor group showed markedly decreased miR-373 expression and invasive ability（all P ＜ 0.05）.Conclusion MiR-373 downregulation can significantly suppress the invasion of A431 cells,and obviously decrease the protein expression of MMP-2 and MMP-9.

Neoplasms,squamous cell;Skin;MicroRNAs;Neoplasm metastasis;MicroRNA-373

夏永華，Email：751195651@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.005

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目（2011A320017）；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研培育基金（2013QN118）

Fund programs:Key Program for Science and Technology Research of Henan Educational Committee （2011A320017）;Scientific Research Cultivation Fund of Xinxiang Medical University（2013QN118）

2016-12-23）

（本文編輯：吳曉初）