李 元，劉 珊，祝 俊

（中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

酶催化合成L-茶氨酸的研究進(jìn)展

李 元，劉 珊，祝 俊*

（中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308）

L-茶氨酸是茶葉中的特征氨基酸，具有改善食品風(fēng)味、放松減壓、增強(qiáng)抗腫瘤藥物療效等多種功能。本文介紹了L-茶氨酸的生理功能及其在食品、保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用，并重點對L-茶氨酸的酶法合成進(jìn)行了綜述，在此基礎(chǔ)上探討了工業(yè)化生產(chǎn)L-茶氨酸的未來可能的研究方向，以期為利用酶法實現(xiàn)L-茶氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

茶葉；L-茶氨酸；生物合成；酶

L-茶氨酸（L-theanine）屬于酰胺類化合物，分子式為C7H14N2O3，是茶葉中含量最豐富的游離氨基酸，占總游離氨基酸含量的50%以上。它是茶葉香味和口感的主要成分，因此它的含量多少對茶葉的風(fēng)味和品質(zhì)起到關(guān)鍵性的作用。大量研究結(jié)果表明L-茶氨酸具有多種重要的生理功能[1]，因而被廣泛應(yīng)用于食品、保健品及醫(yī)藥行業(yè)中。

L-茶氨酸可從茶葉中提取分離[2-3]，但其僅占茶葉干質(zhì)量的1%～2%[4]；另外，由于缺乏簡便、特異和高效的分離方法，高純度L-茶氨酸的提取分離通常涉及耗時、高成本和復(fù)雜的操作過程，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。與此相反，化學(xué)法[5-6]合成L-茶氨酸具有方法簡單、成本低、產(chǎn)率高等優(yōu)點，但是合成的茶氨酸為L-和D-形式的外消旋混合物，通常被認(rèn)為是“非天然”產(chǎn)物，其安全性評價亟待研究。

近年來，隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，L-茶氨酸的生物合成[7-11]備受關(guān)注。目前應(yīng)用于L-茶氨酸合成的生物酶主要有L-谷氨酰胺酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，GGT）、L-谷氨酰胺合成酶（L-glutamine synthetase，GS）、γ-谷氨酰甲胺合成酶（γ-glutamylmethylamide synthetase，GMAS）和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）。本文結(jié)合本課題組的前期工作，參考近年來國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)對L-茶氨酸的生理功能及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了概述，并著重綜述了L-茶氨酸酶催化合成方法的研究進(jìn)展，探討了未來可能的研究方向和方法，以期為L-茶氨酸的研究開發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)，并為其生物合成的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 L-茶氨酸的生理功能及應(yīng)用現(xiàn)狀

L-茶氨酸具有多種重要的生理功能，如：通過調(diào)節(jié)腦中神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)的濃度降低血壓[12]；與抗腫瘤藥物并用時，增強(qiáng)抗腫瘤藥物的抗癌效果，并減少抗腫瘤藥物的副作用[13]；抑制短暫腦缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡，對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[14-15]；影響腦中多巴胺等神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)的代謝和釋放，從而改善認(rèn)知能力和提高學(xué)習(xí)能力[16]、放松減壓并緩解焦慮[17]；提高免疫力[18]；減肥作用[19]等。

L-茶氨酸作為一種安全、集多種生理功能于一體的功能性活性因子，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品和醫(yī)藥行業(yè)。在食品行業(yè)，由于具有優(yōu)良的加工特性和穩(wěn)定性，L-茶氨酸主要用作茶飲料、食品的風(fēng)味改良劑和功能性食品的添加劑[20]，如美國達(dá)拉斯VIB Holdings LLC公司生產(chǎn)的以L-茶氨酸為添加劑的安神飲料Vacation in a Bottle。在保健品行業(yè)，L-茶氨酸作為天然鎮(zhèn)靜劑、抗抑郁劑在國外市場上大受歡迎，日本、美國市場上已有多種不同品牌的茶氨酸保健產(chǎn)品[21]，如美國保健品牌Doctor’s Best的L-茶氨酸膠囊；然而，在國內(nèi)L-茶氨酸主要是銷往國外，國內(nèi)基本沒有茶氨酸類的保健品上市。在醫(yī)藥行業(yè)，L-茶氨酸可開發(fā)為治療腫瘤的輔助藥物、降壓藥物或可用于安神鎮(zhèn)靜藥物中等，目前日本已經(jīng)把L-茶氨酸作為有效成分用于鎮(zhèn)靜劑中。近年來，L-茶氨酸生理功能和藥理藥效實驗的研究表明其在保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域中具有巨大的應(yīng)用價值和廣闊的開發(fā)前景。

2 生物體內(nèi)L-茶氨酸的合成

在茶樹中，L-茶氨酸合成酶（theanine synthetase，TS）在ATP供能的條件下，催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸[22]，如圖1所示。Sasaoka等[23]對TS的性質(zhì)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該酶為茶樹特有的合成酶，對乙胺具有高親合力，然而其非常不穩(wěn)定并且難以分離，不適宜體外合成L-茶氨酸，因此限制了其在L-茶氨酸體外合成中的應(yīng)用。

圖1 茶樹中L-茶氨酸的生物合成[24]Fig. 1 Biosynthesis of L-theanine in the tea plant[24]

3 酶催化體外合成L-茶氨酸

隨著基因工程技術(shù)的深入開展，研究人員對酶促體外合成L-茶氨酸進(jìn)行了不斷地探索和技術(shù)創(chuàng)新。目前，用于L-茶氨酸體外合成的酶如圖2所示，主要包括：1）以L-谷氨酰胺為底物、基于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶：L-谷氨酰胺酶和GGT；2）以L-谷氨酸為底物、需ATP供能的合成酶：GS、GMAS和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶γ-GCS。L-谷氨酰胺酶和GGT催化L-谷氨酰胺和乙胺合成L-茶氨酸；GS、GMAS和γ-GCS在ATP存在條件下催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸。

圖2 酶催化合成L-茶氨酸Fig. 2 Biosynthesis of L-theanine by various enzymes

3.1 L-谷氨酰胺酶催化L-茶氨酸合成

L-谷氨酰胺酶是一種酰胺基水解酶[25]，催化L-谷氨酰胺的γ-酰胺鍵水解為L-谷氨酸和游離氨（圖3A），在原核和真核生物中廣泛分布。此外，一些L-谷氨酰胺酶還可催化L-谷氨酰胺的γ-谷氨酰基的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，例如來自硝基還原假單胞菌Pseudomonas nitroreducens的L-谷氨酰胺酶[26]，其可催化羥胺、甲胺和乙胺作為受體分子的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，如圖3B所示，其中當(dāng)乙胺作為受體分子時形成L-茶氨酸。Tachiki[27]和Pu Hefang[28]等分別對天然形式的來自菌株P(guān). nitroreducensIFO 12694的L-谷氨酰胺酶和重組形式的來自菌株P(guān). nitroreducensDSM14399的L-谷氨酰胺酶進(jìn)行了深入研究，其催化合成L-茶氨酸的反應(yīng)條件如表1所示。

圖3 L-谷氨酰胺酶催化的反應(yīng)[25]Fig. 3 Reactions catalyzed by L-glutaminase[25]

為了增強(qiáng)L-谷氨酰胺酶的穩(wěn)定性和可復(fù)用性，Yokoyama等[29]使用介孔二氧化硅（mesoporous silica，MPS）作為固定化載體對菌株IFO 12694的L-谷氨酰胺酶進(jìn)行了固定化，并通過用氧化鋯表面修飾提高M(jìn)PS在高pH值下的穩(wěn)定性，從而改善固定化酶對于L-茶氨酸生產(chǎn)的可復(fù)用性。Itoh等[30]使用碳包覆MPS的孔表面也獲得了類似的效果。此外，Matsuura等[31]開發(fā)了包含L-谷氨酰胺酶-MPS組合物的流動型微反應(yīng)器，可用于連續(xù)合成L-茶氨酸。

表1 各種來源L-谷氨酰胺酶催化合成L-茶氨酸方法的比較Table 1 Comparative analysis of the methods available for enzymatic synthesis of L-theanine using L-glutaminase from various sources

除了P. nitroreducens外，來自香茅醇假單胞菌P. citronellosis GEA FERM BP-8353所衍生的L-谷氨酰胺酶也可合成L-茶氨酸[32]。該菌株為日本太陽化學(xué)株式會社研究人員從土壤中分離出的一種新細(xì)菌。使用P. citronellosis GEA的無細(xì)胞提取物合成L-茶氨酸時，在0.3 mol/L L-谷氨酰胺和0.9 mol/L乙胺時反應(yīng)最佳，30 ℃、pH 11.0孵育48 h后，轉(zhuǎn)化率達(dá)到約55%。

3.2 GGT催化L-茶氨酸合成

圖 4 GGT催化的反應(yīng)[33]Fig. 4 Reactions catalyzed by GGT[33]

GGT催化γ-谷氨酰化合物的γ-谷氨?；糠洲D(zhuǎn)移到其他氨基酸和短肽上[33]（圖4A），當(dāng)水作為γ-谷氨酰基受體時，其催化γ-谷氨?；衔锏乃猓▓D4B）。

GGT廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動物的一系列生物體中。相比哺乳動物，細(xì)菌GGT具有更廣泛的底物特異性，目前用于L-茶氨酸合成的GGT均來自于細(xì)菌。2002年，Suzuki等[34]首次發(fā)現(xiàn)來自大腸桿菌Escherichia coli K-12的GGT可催化γ-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸，轉(zhuǎn)化率為60%。隨后研究者們對使用來自E. coli[35-39]、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[40-43]和地衣芽孢桿菌B. licheniformis[44]的GGT催化合成L-茶氨酸進(jìn)行了深入研究，如表2所示。

理論上，GGT催化合成L-茶氨酸可使用各種γ-谷氨?；w，其轉(zhuǎn)肽活性隨γ-谷氨?；w而變化。例如，來自B. licheniformis的GGT以L-谷氨酰胺作為γ-谷氨?；w時，相對活力是以GAME作為供體的4.4 倍[45]；相反地，當(dāng)使用GMAE代替L-谷氨酰胺作為供體時，來自E. coli K-12的GGT的相對活力增加1.2 倍[36]。當(dāng)以GAME為γ-谷氨?；w時，使用含有GGT的E. coli全細(xì)胞催化L-茶氨酸合成轉(zhuǎn)化率可達(dá)95%[36]；使用固定化的含有GGT的E. coli全細(xì)胞催化L-茶氨酸合成，在使用6 次后，平均轉(zhuǎn)化率可達(dá)87.2%[37]。2013年，Zhang Hongjuan等[39]報道了利用各種取代的γ-谷氨酰基苯胺為γ-谷氨?；w，使用來自E. coli的GGT催化合成L-茶氨酸。

與L-谷氨酰胺酶相似，通過GGT催化合成L-茶氨酸時，無需ATP參與；然而通常需要使用較高濃度的乙胺和優(yōu)化反應(yīng)pH值以抑制底物L(fēng)-谷氨酰胺的水解和因自轉(zhuǎn)肽作用形成γ-谷氨酰-谷氨酰胺副產(chǎn)物。為了減少通過GGT生物合成L-茶氨酸期間的底物水解和自轉(zhuǎn)肽副反應(yīng)，Wang Haoqi等[41]使用其中游離α-氨基和羧基被Zn封閉的L-谷氨酰胺-Zn（Ⅱ）絡(luò)合物代替L-谷氨酰胺作為底物，其L-茶氨酸產(chǎn)率增加了16.9%。

表2 各種來源GGT催化合成L-茶氨酸方法的比較Table 2 Comparative analysis of the methods available for enzymatic synthesis of L-theanine using GGT from various sources

表3 各種來源GS和GMAS酶學(xué)性質(zhì)的比較Table 3 Comparative enzymatic characterization of GS and GMAS from various sources

3.3 GS催化L-茶氨酸合成

GS在ATP存在條件下，催化L-谷氨酸鹽和游離氨轉(zhuǎn)化為L-谷氨酰胺。Tachiki等[46-47]首次對來自谷氨酸微球菌Micrococcus glutamicus ATCC 13032的GS催化L-谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸進(jìn)行了報道。隨后，Yamamoto等[48]對來自腐臭假單胞菌Pseudomonas taetrolens Y-30菌株的GS進(jìn)行了純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，經(jīng)表征其具有生產(chǎn)L-茶氨酸的能力；該來源編碼GS的基因已在E. coli中成功表達(dá)，重組的GS顯示與天然GS具有相同的性質(zhì)，且該酶在表達(dá)系統(tǒng)中的生產(chǎn)能力比在原始細(xì)菌P. taetrolens Y-30中高約30 倍[49]。在GS催化L-茶氨酸合成時，需要ATP參與，因此該課題組將“偶聯(lián)發(fā)酵與能量轉(zhuǎn)移”的酵母糖酵解ATP再生系統(tǒng)應(yīng)用于GS生物合成L-茶氨酸中，反應(yīng)體系經(jīng)過優(yōu)化后，200 mmol/L L-谷氨酸可產(chǎn)生170 mmol/L L-茶氨酸[50]。此外，Zhou Xin等[51]研究表明來自B. subtilis的GS能在E. coli BL21（DE3）/pET28a-glnA細(xì)胞中作為可溶性蛋白高效表達(dá)（約占總蛋白的86%）；在pH 7.5和Mn2+濃度為10 mmol/L條件下，重組GS具有最大的L-茶氨酸合成活力（6.4 U/mg）。

3.4 GMAS催化L-茶氨酸合成

GMAS在ATP供能的條件下催化L-谷氨酸和甲胺合成γ-谷氨酰甲胺（γ-glutamylmethylamide，γ-GMA）；對于依賴甲胺作為單獨的碳源和氮源的細(xì)菌，GMAS在甲胺代謝中間體γ-GMA的生物合成中發(fā)揮著重要作用[52]。相比GS，其對乙胺顯示出更高的活性，各種來源的GMAS和GS酶學(xué)性質(zhì)的比較如表3所示。

1 9 9 2年，K i m u r a等[53]首次從噬甲基菌株Methylophaga sp. AA-30中純化出GMAS，該酶在pH 7.5 和40 ℃條件下有最大活性，表現(xiàn)出較寬的底物特異性范圍，并能以乙胺和L-谷氨酸為底物催化合成L-茶氨酸，但未進(jìn)行深入研究。2007年，Yamamoto等[54]從200多種甲胺和/或甲醇同化細(xì)菌中篩選出M. mays No. 9作為L-茶氨酸生產(chǎn)菌，并從中分離出GMAS，該酶在中性pH值范圍對乙胺具有較高的活性；同時在較低底物濃度條件下，該酶催化的L-茶氨酸產(chǎn)量高于P. taetrolens Y-30 GS大約20 倍。隨后該課題組將M. mays No. 9中編碼GMAS的基因在E. coli中進(jìn)行了重組表達(dá)，結(jié)果表明重組菌的產(chǎn)酶能力可比原始M. mays No. 9高23 倍，而重組GMAS的酶學(xué)性質(zhì)與天然GMAS無明顯不同[55]，這使得大量生產(chǎn)GMAS用于工業(yè)L-茶氨酸生產(chǎn)成為可能；以重組GMAS作為催化劑，研究了偶聯(lián)酵母糖酵解ATP再生的L-茶氨酸生物合成，結(jié)果表明含600 mmol/L L-谷氨酸鈉、600 mmol/L鹽酸乙胺、300 mmol/L葡萄糖、200 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）、30 mmol/L MgCl2、5 mmol/L MnCl2、5 mmol/L單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、30 U/mL GMAS 和40 g/L 酵母細(xì)胞的1 mL混合體系中，在48 h內(nèi)可催化合成約110 g/L L-茶氨酸[56]。另外，該課題組將GMAS和酵母干細(xì)胞封閉于透析膜管中，該膜封閉酶制備法可實現(xiàn)600 mmol/L L-谷氨酸和乙胺100%轉(zhuǎn)化為L-茶氨酸，且在含NAD+混合反應(yīng)液中經(jīng)6 次連續(xù)反應(yīng)仍能保持較高的L-茶氨酸生產(chǎn)能力[57]。

與L-谷氨酰胺酶和GGT相比，GMAS在催化L-茶氨酸合成時，以廉價的L-谷氨酸鹽為原料，只需要添加等當(dāng)量的乙胺，而無需考慮L-谷氨酰胺為底物時由于其水解及自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)帶來的副產(chǎn)物問題。然而，與GS相似，GMAS在催化L-茶氨酸的合成中是需要ATP參與的，ATP再生是關(guān)系到GMAS用于工業(yè)化生產(chǎn)L-茶氨酸的關(guān)鍵。鑒于重組GMAS在L-茶氨酸合成中所表現(xiàn)出的優(yōu)勢，本課題組開發(fā)了偶聯(lián)基于磷酸激酶（polyphosphate kinase，PPK）的ATP再生系統(tǒng)的酶法L-茶氨酸合成路線[58]，如圖5所示，通過PPK催化，以廉價易得的多聚磷酸鹽（polyphosphate，polyP）為底物實現(xiàn)ATP再生，在200 mL反應(yīng)體系中，添加催化量的ATP，以400 mmol/L L-谷氨酸和乙胺為底物，實現(xiàn)了L-茶氨酸84%的產(chǎn)率。該反應(yīng)體系基于酶法ATP再生，相比酵母糖酵解ATP再生，體系簡單易控，有利于工業(yè)化生產(chǎn)L-茶氨酸，相關(guān)反應(yīng)體系比較如表4所示。

表4 各種來源GS和GMAS催化合成L-茶氨酸方法的比較Table 4 Comparative analysis of the methods available for enzymatic synthesis of L-theanine using GS and GMAS from various sources

圖5 偶聯(lián)基于PPK ATP再生酶法合成L-茶氨酸[58]Fig. 5 Enzymatic synthesis of L-theanine by GMAS coupled with an ATP regeneration system based on PPK[58]

3.5 GCS合成酶催化L-茶氨酸合成

γ-GCS在ATP供能條件下，以L-谷氨酸和L-半胱氨酸為底物催化合成γ-谷氨酰半胱氨酸，是生物體內(nèi)合成谷胱甘肽的重要用酶[59]。Miyake等[60]報道了來自E. coli的γ-GCS具有催化L-谷氨酸和脂肪胺類生成γ-谷氨酰胺類化合物的能力，且反應(yīng)速度與亞甲基長度有關(guān)（正丙胺＞丁胺＞乙胺＞＞甲胺）；利用重組E. coli DH5α/pGSK1表達(dá)的γ-GCS催化，并偶聯(lián)E. coli自身ATP再生系統(tǒng)，18 h后能以429 mmol/L乙胺合成12.1 mmol/L L-茶氨酸。然而，該酶對乙胺的底物特異性較差，需要對其進(jìn)行進(jìn)一步改造，以提高其底物特異性。

4 結(jié) 語

L-茶氨酸因其獨特的生物學(xué)功能，在食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域必將有著巨大的應(yīng)用價值和廣闊的開發(fā)前景，所以實現(xiàn)L-茶氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)尤為重要。由于高效、節(jié)能、環(huán)境友好等優(yōu)點，酶催化合成L-茶氨酸日益受到青睞。目前L-茶氨酸的酶法合成已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但仍存在一些問題：1）使用L-谷氨酰胺酶和GGT催化L-谷氨酰胺及衍生物與乙胺合成L-茶氨酸，反應(yīng)過程中不需要ATP參與，然而需要使用過量乙胺并在堿性條件下反應(yīng)，以抑制底物L(fēng)-谷氨酰胺水解及自轉(zhuǎn)肽作用；另外，還存在底物濃度偏低和轉(zhuǎn)化效率不高的問題。2）使用GS、GMAS及γ-GCS催化L-谷氨酸與乙胺合成L-茶氨酸，不存在底物水解及自轉(zhuǎn)肽等副反應(yīng)，然而反應(yīng)過程需要ATP參與，使得ATP再生成為此類酶，特別是GMAS，應(yīng)用于L-茶氨酸工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。因此，可從以下幾個方面進(jìn)行深入研究：1）進(jìn)一步表征這些酶的晶體結(jié)構(gòu)，從而更完善地闡明乙胺結(jié)合以及通過γ-谷氨酰基的轉(zhuǎn)移或L-谷氨酸的連接生物合成L-茶氨酸的分子機(jī)制，以更好地利用定向進(jìn)化技術(shù)提高酶對乙胺的底物特異性、催化活性和穩(wěn)定性，進(jìn)一步提高合成L-茶氨酸的效率。2）利用生物信息學(xué)中的基因挖掘技術(shù)從自然界中篩查和表征更多具有催化L-茶氨酸合成功能的酶，并比較其酶性質(zhì)和合成L-茶氨酸的能力，以開發(fā)更有效的酶用于L-茶氨酸的工業(yè)生產(chǎn)。3）開發(fā)更高效的ATP再生系統(tǒng)，以解決GMAS等酶在工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用中的瓶頸問題。

[1] LIANG Y R, LIU C, XIANG L P, et al. Health benef i ts of theanine in green tea: a review[J]. Tropical Journal of Pharmaceutical Research,2015, 14(10): 1943-1949. DOI:10.4314/tjpr.v14i10.29.

[2] VUONG Q V, STATHOPOULOS C E, GOLDING J B, et al.Optimum conditions for the water extraction of L-theanine from green tea[J]. Journal of Separation Science, 2011, 34(18): 2468-2474.DOI:10.1002/jssc.201100401.

[3] YE J H, JIN J, LUO Y W, et al. Isolation of L-theanine from tea solution by cation exchange resin in batch and fi xed bed column[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2011, 16(2): 256-263.DOI:10.1007/s12257-010-0223-8.

[4] CARTWRIGHT R A, ROBERTS E A H, WOOD D J. Theanine, an amino-acid N-ethyl amide present in tea[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1954, 5(12): 597-599. DOI:10.1002/jsfa.2740051208.

[5] GU H N, JIANG Y X, WANG J. A practical synthesis of ethyl L-glutamine (L-theanine)[J]. Organic Preparations and Procedures International, 2004, 36(2): 182-185.DOI:10.1080/00304940409355394.

[6] ZHANG Z Z, YAN S H, LI D X, et al. Chemical synthesis and the stability of theanine[J]. Advanced Materials Research, 2012,396/397/398: 1273-1277. DOI:10.4028/www.scientif i c.net/AMR.396-398.1273.

[7] VUONG Q V, BOWYER M C, ROACH P D. L-Theanine: properties,synthesis and isolation from tea[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011, 91(11): 1931-1939. DOI:10.1002/Jsfa.4373.

[8] MU W M, ZHANG T, JIANG B. An overview of biological production of L-theanine[J]. Biotechnology Advances, 2015, 33(3/4):335-342. DOI:10.1016/j.biotechadv.2015.04.004.

[9] 陳林, 張正竹, 陳鍵, 等. 茶氨酸酶促生物合成研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué), 2011, 31(1): 1-10.

[10] 羅晶晶, 張靈枝, 王登良. 生物技術(shù)在茶氨酸合成上的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 廣東茶業(yè), 2013(增刊1): 13-15. DOI:10.3969/j.issn.1672-7398.2013.01.005.

[11] 賁培玲, 朱巖巖, 殷志敏. L-茶氨酸生物制備技術(shù)和生物功能研究進(jìn)展[J]. 中國茶葉加工, 2015(4): 19-25.

[12] YOTO A, MOTOKI M, MURAO S, et al. Effects of L-theanine or caffeine intake on changes in blood pressure under physical and psychological stresses[J]. Journal of Physiological Anthropology,2012, 31: 1-9. DOI:10.1186/1880-6805-31-28.

[13] LI L, WANG X R, XIONG Y, et al. L-Theanine: a promising substance in tumor research[J]. Journal of Food Agriculture and Environment, 2013, 11(1): 25-27.

[14] THANGARAJAN S, DEIVASIGAMANI A, NATARAJAN S S, et al.Neuroprotective activity of L-theanine on 3-nitropropionic acid-induced neurotoxicity in rat striatum[J]. International Journal of Neuroscience,2014, 124(9): 673-684. DOI:10.3109/00207454.2013.872642.

[15] ZHAO Y, ZHAO B L. The neuroprotective effect of L-theanine and its inhibition on nicotine dependence[J]. Chinese Science Bulletin, 2014,59(31): 4014-4019. DOI:10.1007/s11434-014-0529-6.

[16] TAMANO H, FUKURA K, SUZUKI M, et al. Advantageous effect of theanine intake on cognition[J]. Nutritional Neuroscience, 2014, 17(6):279-283. DOI:10.1179/1476830513Y.0000000094.

[17] UNNO K, TANIDA N, ISHII N, et al. Anti-stress effect of theanine on students during pharmacy practice: positive correlation among salivary alpha-amylase activity, trait anxiety and subjective stress[J].Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2013, 111: 128-135.DOI:10.1016/j.pbb.2013.09.004.

[18] LI C J, TONG H O, YAN Q X, et al. L-Theanine improves immunity by altering TH2/TH1 cytokine balance, brain neurotransmitters,and expression of phospholipase C in rat hearts[J]. Medical Science Monitor, 2016, 22: 662-669. DOI:10.12659/MSM.897077.

[19] ZHENG G D, SAYAMA K, OKUBO T, et al. Anti-obesity effects of three major components of green tea, catechins, caffeine and theanine,in mice[J]. In Vivo, 2004, 18(1): 55-62.

[20] 朱松, 王洪新. 茶氨酸的生理功能及在食品中的應(yīng)用[J]. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(3): 18-20. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2005.03.006.

[21] 帥玉英, 沈宇峰, 黃海娟, 等. 功能性配料L-茶氨酸的生產(chǎn)應(yīng)用與法規(guī)情況簡介[J]. 中國食品添加劑, 2013, 117(2): 181-185.DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2013.02.021.

[22] ASHIHARA H. Occurrence, biosynthesis and metabolism of theanine(gamma-glutamyl-L-ethylamide) in plants: a comprehensive review[J].Natural Product Communications, 2015, 10(5): 803-810.

[23] SASAOKA K, KITO M, ONISHI Y. Some properties of theanine synthesizing enzyme in tea seedlings[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1965, 29(11): 984-988. DOI:10.1080/00021369.1965.10858501.

[24] DENG W W, OGITA S, ASHIHARA H. Biosynthesis of theanine(gamma-ethylamino-L-glutamic acid) in seedlings of Camellia sinensis[J]. Phytochemistry Letters, 2008, 1(2): 115-119.DOI:10.1016/j.phytol.2008.06.002.

[25] NANDAKUMARA R, YOSHIMUNE K, WAKAYAMAC M, et al.Microbial glutaminase: biochemistry, molecular approaches and applications in the food industry[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2003, 23(2/3/4/5/6): 87-100. DOI:10.1016/S1381-1177(03)00075-4.

[26] TACHIKI T, YAMADA T, UEDA M, et al. Purification and some properties of glutaminase from Pseudomonas nitroreducens IFO 12694[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1996, 60(7):1160-1164. DOI:10.1271/bbb.60.1160.

[27] TACHIKI T, YAMADA T, MIZUNO K, et al. Gamma-glutamyl transfer reactions by glutaminase from Pseudomonas nitroreducens IFO12694 and their application for the syntheses of theanine and gamma-glutamylmethylamide[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1998, 62(7): 1279-1283. DOI:10.1271/Bbb.62.1279.

[28] PU Hefang, WANG Qi, ZHU Fenfen, et al. Cloning, expression of glutaminase from Pseudomonas nitroreducens and application to theanine synthesis[J]. Biocatalysis and Biotransformation, 2013, 31(1):1-7. DOI:10.3109/10242422.2012.749462.

[29] YOKOYAMA T, ISHII R, ITOH T, et al. Synthesis of L-theanine using enzyme/mesoporous silica conjugates under high pH conditions[J].Materials Letters, 2011, 65(1): 67-69. DOI:10.1016/j.matlet.2010.09.016.

[30] ITOH T, HOSHIKAWA Y, MATSUURA S, et al. Production of L-theanine using glutaminase encapsulated in carbon-coated mesoporous silica with high pH stability[J]. Biochemical Engineering Journal, 2012, 68: 207-214. DOI:10.1016/j.bej.2012.07.012.

[31] MATSUURA S, YOKOYAMA T, ISHII R, et al. An enzymeencapsulated microreactor for efficient theanine synthesis[J].Chemical Communications, 2012, 48(56): 7058-7060. DOI:10.1039/C2cc32271d.

[32] TACHIKI T, OKADA Y, OZEKI M, et al. Process for producing theanine: US7335497[P]. (2008-02-16)[2016-08-20].

[33] CASTELLANO I, MERLINO A. γ-Glutamyltranspeptidases:sequence, structure, biochemical properties, and biotechnological applications[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2012, 69(20):3381-3394. DOI:10.1007/s00018-012-0988-3.

[34] SUZUKI H, IZUKA S, MIYAKAWA N, et al. Enzymatic production of theanine, an “umami” component of tea, from glutamine and ethylamine with bacterial gamma-glutamyltranspeptidase[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2002, 31(6): 884-889. DOI:10.1016/S0141-0229(02)00213-2.

[35] YAO Y F, WENG Y M, HU H Y, et al. Expression optimization and biochemical characterization of a recombinant gammaglutamyltranspeptidase from Escherichia coli Novablue[J]. Protein Journal, 2006, 25(6): 431-441. DOI:10.1007/s10930-006-9037-0.

[36] ZHANG F, ZHENG Q Z, JIAO Q C, et al. Synthesis of theanine from glutamic acid gamma-methyl ester and ethylamine catalyzed by Escherichia coli having gamma-glutamyltranspeptidase activity[J].Biotechnology Letters, 2010, 32(8): 1147-1150. DOI:10.1007/s10529-010-0273-1.

[37] ZHANG F, ZHENG Q Z, JIAO Q C, et al. Enzymatic synthesis of theanine from glutamic acid gamma-methyl ester and ethylamine by immobilized Escherichia coli cells with gamma-glutamyltranspeptidase activity[J]. Amino Acids, 2010, 39(5): 1177-1182. DOI:10.1007/s00726-010-0553-z.

[38] WANG Q, MIN C, ZHU F F, et al. Production of bioactive gammaglutamyl transpeptidase in Escherichia coli using sumo fusion partner and application of the recombinant enzyme to L-theanine synthesis[J].Current Microbiology, 2011, 62(5): 1535-1541. DOI:10.1007/s00284-011-9891-7.

[39] ZHANG Hongjuan, ZHANG Weiguo, WANG Zhiyuan, et al.Enzymatic synthesis of theanine with Escherichia coli gammaglutamyltranspeptidase from a series of gamma-glutamyl anilide substrate analogues[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering,2013, 18(2): 358-364. DOI:10.1007/s12257-012-0644-7.

[40] SHUAI Y Y, ZHANG T, JIANG B, et al. Development of efficient enzymatic production of theanine by gamma-glutamyltranspeptidase from a newly isolated strain of Bacillus subtilis, SK11.004[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90(15): 2563-2567.DOI:10.1002/jsfa.4120.

[41] WANG Haoqi, YAO Zhong, ZHOU Zhi, et al. Enzymatic synthesis of theanine with L-glutamine-Zn(Ⅱ) complexes[J]. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2012, 17(6): 1135-1139. DOI:10.1007/s12257-012-0205-0.

[42] CHEN X Y, SU L Q, WU D, et al. Application of recombinant Bacillus subtilis gamma-glutamyltranspeptidase to the production of L-theanine[J]. Process Biochemistry, 2014, 49(9): 1429-1439.DOI:10.1016/j.procbio.2014.05.019.

[43] 傅嘉懿, 陳晟, 吳敬. γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶補(bǔ)料法合成L-茶氨酸工藝研究[J]. 生物技術(shù)通報, 2016, 32(2): 165-171. DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.022.

[44] BINDAL S, GUPTA R. L-Theanine synthesis using gammaglutamyl transpeptidase from Bacillus licheniformis ER-15[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62(37): 9151-9159.DOI:10.1021/jf5022913.

[45] LIN L L, CHOU P R, HUA Y W, et al. Overexpression, one-step purification, and biochemical characterization of a recombinant gamma-glutamyltranspeptidase from Bacillus licheniformis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 73(1): 103-112. DOI:10.1007/s00253-006-0440-4.

[46] TACHIKI T, WAKISAKA S, KUMAGAI H, et al. Glutamine synthetase from Micrococcus glutamicus: effect of nitrogen sources in culture medium on enzyme formation and some properties of crystalline enzyme[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1981,45(6): 1487-1492. DOI:10.1271/bbb1961.45.1487.

[47] TACHIKI T, SUZUKI H, WAKISAKA S, et al. Production of γ-glutamylmethylamide and γ-glutamylethylamide by coupling of baker’s yeast preparations and bacterial glutamine synthetase[J]. The Journal of General and Applied Microbiology, 1986, 32(6): 545-548.DOI:10.2323/jgam.32.545.

[48] YAMAMOTO S, UCHIMURA K, WAKAYAMA M, et al.Purification and characterization of glutamine synthetase of Pseudomonas taetrolens Y-30: an enzyme usable for production of theanine by coupling with the alcoholic fermentation system of baker’s yeast[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2004, 68(9):1888-1897. DOI:10.1271/Bbb.68.1888.

[49] YAMAMOTO S, WAKAYAMA M, TACHIKI T. Cloning and expression of Pseudomonas taetrolens Y-30 gene encoding glutamine synthetase: an enzyme available for theanine production by coupled fermentation with energy transfer[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2006, 70(2): 500-507. DOI:10.1271/Bbb.70.500.

[50] YAMAMOTO S, WAKAYAMA M, TACHIKI T. Theanine production by coupled fermentation with energy transfer employing Pseudomonas taetrolens Y-30 glutamine synthetase and baker’s yeast cells[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2005, 69(4):784-789. DOI:10.1271/Bbb.69.784.

[51] ZHOU Xin, ZHANG Zhengping, JIA Xiaohe, et al. Mn2+enhances theanine-forming activity of recombinant glutamine synthetase from Bacillus subtilis in Escherichia coli[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(8): 1267-1272.DOI:10.1007/s11274-007-9599-9.

[52] KIMURA T, SUGAHARA I, HAYASHI K, et al. Primary metabolic pathway of methylamine in Methylophaga sp. AA-30[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1990, 54(11): 2819-2826. DOI:10.1080/000 21369.1990.10870440.

[53] KIMURA T, SUGAHARA I, HANAI K, et al. Purification and characterization of gamma-glutamylmethylamide synthetase from Methylophaga sp. AA-30[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1992, 56(5): 708-711. DOI:10.1271/bbb.56.708.

[54] YAMAMOTO S, WAKAYAMA M, TACHIKI T. Characterization of theanine-forming enzyme from Methylovorus mays No. 9 in respect to utilization of theanine production[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2007, 71(2): 545-552. DOI:10.1271/Bbb.60590.

[55] YAMAMOTO S, WAKAYAMA M, TACHIKI T. Cloning and expression of Methylovorus mays No. 9 gene encoding gammaglutamylmethylamide synthetase: an enzyme usable in theanine formation by coupling with the alcoholic fermentation system of baker’s yeast[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2008,72(1): 101-109. DOI:10.1271/Bbb.70462.

[56] YAMAMOTO S, MORIHARA Y, WAKAYAMA M, et al. Theanine production by coupled fermentation with energy transfer using gammaglutamylmethylamide synthetase of Methylovorus mays No. 9[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2008, 72(5): 1206-1211.DOI:10.1271/Bbb.70663.

[57] YAMAMOTO S, MORIHARA Y, WAKAYAMA M, et al. Repeated batch production of theanine by coupled fermentation with energy transfer using membrane-enclosed gamma-glutamylmethylamide synthetase and dried yeast cells[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2009, 73(12): 2800-2802. DOI:10.1271/Bbb.90647.

[58] LIU S, LI Y, ZHU J. Enzymatic production of L-theanine by gammaglutamylmethylamide synthetase coupling with an ATP regeneration system based on polyphosphate kinase[J]. Process Biochemistry, 2016,51(10): 1458-1463. DOI:10.1016/j.procbio.2016.06.006.

[59] KELLY B S, ANTHOLINE W E, GRIFFITH O W. Escherichia coli gamma-glutamylcysteine synthetase - two active site metal ions affect substrate and inhibitor binding[J]. Journal of Biological Chemistry,2002, 277(1): 50-58. DOI:10.1074/jbc.M107961200.

[60] MIYAKE K, KAKITA S. A novel catalytic ability of gammaglutamylcysteine synthetase of Escherichia coli and its application in theanine production[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2009, 73(12): 2677-2683. DOI:10.1271/Bbb.90538.

Process in Enzymatic Synthesis of L-Theanine

LI Yuan, LIU Shan, ZHU Jun*(Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)

L-theanine (γ-glutamylethylamide), a unique non-protein-derived amino acid in tea, has a broad range of bioactivities, such as improving food fl avor, releasing pressure and enhancing the eff i ciency of anticancer agents. Herein,the physiological and pharmacological activities of L-theanine and its applications in food, health and medical industries are summarized with focus on the enzymatic synthesis of L-theanine. Moreover, directions for future research are also discussed in the hope of providing a guideline for the large-scale industrial production of L-theanine.

tea; L-theanine; biosynthesis; enzyme

10.7506/spkx1002-6630-201723047

TS202.3

A

1002-6630（2017）23-0298-07

李元, 劉珊, ?？? 酶催化合成L-茶氨酸的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23): 298-304.

10.7506/spkx1002-6630-201723047. http://www.spkx.net.cn

LI Yuan, LIU Shan, ZHU Jun. Process in enzymatic synthesis of L-theanine[J]. Food Science, 2017, 38(23): 298-304. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723047. http://www.spkx.net.cn

2016-09-09

天津市科技計劃項目（14ZCZDSY00064）

李元（1986—），女，助理研究員，碩士，研究方向為生物催化。E-mail：li_yuan@tib.cas.cn

*通信作者：祝?。?962—），男，研究員，博士，研究方向為酶工程與生物催化。E-mail：zhu_j@tib.cas.cn