匡 聰，賈俊強,2,*，吳瓊英,2,*，張雪紛，桂仲爭,2

（1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

超聲-離子液體處理對乳清蛋白酶解動力學(xué)及其產(chǎn)物抗氧化活性的影響

匡 聰1，賈俊強1,2,*，吳瓊英1,2,*，張雪紛1，桂仲爭1,2

（1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

為了闡明超聲-離子液體處理后乳清蛋白酶解動力學(xué)特性，研究初始底物質(zhì)量濃度、酶質(zhì)量濃度和酶解時間對乳清蛋白水解度的影響，在此基礎(chǔ)上建立了乳清蛋白-堿性蛋白酶酶解動力學(xué)模型，并通過清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基法、螯合Fe2+法和還原力法研究了超聲-離子液體處理對乳清蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：超聲-離子液體處理后，乳清蛋白的酶解動力學(xué)模型發(fā)生了改變，其酶解反應(yīng)所需的臨界酶質(zhì)量濃度降低了43.1%，這表明超聲-離子液體處理促使了乳清蛋白酶解。抗氧化實驗表明，超聲-離子液體處理后，乳清蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性和螯合Fe2+能力分別提高了14.4%和28.4%，其還原力也得到了改善。體積排阻色譜分析表明，超聲-離子液體處理顯著提高了乳清蛋白酶解產(chǎn)物中＞1～5 ku組分的含量（p＜0.05），比未處理組提高了12.2%。

乳清蛋白；酶解；動力學(xué)；離子液體；超聲處理

酶解技術(shù)是制備生物活性肽的主要方法，科研工作者已利用酶解技術(shù)從食源蛋白質(zhì)中獲得了具有抗氧化[1]、降血壓[2]、提高免疫力[3]和抗菌[4]等作用的生物活性肽。研究發(fā)現(xiàn)，生物活性肽的活性往往與蛋白質(zhì)水解度密切相關(guān)，蛋白質(zhì)水解度過低或過高均可導(dǎo)致酶解產(chǎn)物中生物活性肽的活性降低[5]。蛋白質(zhì)酶解動力學(xué)能夠反映出水解度、反應(yīng)速率隨酶解時間的變化規(guī)律，可有效預(yù)測和控制酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，從而提高目標產(chǎn)物的得率[6]。傳統(tǒng)的酶解動力學(xué)Michaelis-Menten模式主要用于均相反應(yīng)體系中[7]，而蛋白質(zhì)酶解是一個非均相系統(tǒng)反應(yīng)，反應(yīng)過程中會伴隨出現(xiàn)產(chǎn)物抑制、底物抑制以及蛋白酶失活等現(xiàn)象[8]，酶解過程極其復(fù)雜。因此，建立酶解過程動力學(xué)模型，可實現(xiàn)蛋白質(zhì)的可控酶解，以最大限度地獲得所需的生物活性肽。

離子液體是一類由體積相對較大、結(jié)構(gòu)不對稱的有機陽離子和體積相對較小的無機陰離子構(gòu)成的鹽類物質(zhì)[9]。離子液體具有良溶性、不揮發(fā)、熱穩(wěn)定和化學(xué)惰性等特點，已被用于醫(yī)藥、化妝品、制藥以及食品等領(lǐng)域[10]。研究表明，離子液體作用于蛋白后會引起蛋白分子發(fā)生伸展和重新折疊與聚集，蛋白聚集體變得疏松[11]，疏松的蛋白聚集體在酶解時增加了蛋白質(zhì)底物與蛋白酶的結(jié)合率，從而增加了蛋白質(zhì)酶解效率[12]，現(xiàn)已與酶法聯(lián)合使用改善蛋白的功能性[13]。隨著超聲波輔助酶解技術(shù)的發(fā)展，超聲波與離子液體聯(lián)合處理已被用于促進酶解反應(yīng)，Zhang Danni等[14]將超聲-離子液體法用于酶法修飾蟲草酸，將蟲草酸轉(zhuǎn)化為具有高溶解度的5’-O-乙?；?蟲草素，不僅提高了酶解反應(yīng)的速率，而且提高了產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。課題組前期也將超聲-離子液體處理用于制備蠶蛹蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽，發(fā)現(xiàn)蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和ACE抑制活性都得到了提高[12]。然而，迄今為止，超聲-離子液體在蛋白質(zhì)酶解中應(yīng)用的研究并不多。

堿性蛋白酶（alcalase protease，AP）是一種肽鏈內(nèi)切酶，酶切位點主要是肽鏈中疏水性氨基酸殘基的羧基端，已成為制備生物活性肽常用的蛋白酶[15]。研究表明，乳清蛋白經(jīng)AP酶解后，其酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出較強的抗氧化活性[16-17]。本實驗在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇AP作為水解酶，研究超聲-離子液體處理對乳清蛋白酶解動力學(xué)及其產(chǎn)物抗氧化活性的影響，以期為超聲-離子液體處理技術(shù)在蛋白質(zhì)酶解中進一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白 鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司；AP（EC3.4.21.14，酶活力為60 000 U/g） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；1-丁基-3-甲基六氟磷酸鹽（1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，[BMIM]PF6） 上海御略化工有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma-Aldrich公司；菲洛嗪 美國Alfa Aesar公司；牛血清白蛋白（分子質(zhì)量66 446 u）、胃蛋白酶（分子質(zhì)量35 000 u，酶活力3 000～3 500 U/mg）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na） 生工生物工程（上海）股份有限公司；細胞色素c（分子質(zhì)量12 400 u）、胰蛋白酶抑制劑（分子質(zhì)量6 511 u）、人血管緊張素Ⅱ（分子質(zhì)量1 045.5 u）、乙氨酰-乙氨酰-乙氨酸（分子質(zhì)量189.1 u）上海源葉生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FDU-2100冷凍干燥機 日本東京理化器械；H205DR-1高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；BSA124S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SevenMulti型pH計 梅特勒-托利多儀器公司；DF-101B集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；SSY-H型恒溫水浴鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲-離子液體處理乳清蛋白

將乳清蛋白用去離子水配制成1.0 g/100 mL溶液，然后加入等體積[BMIM]PF6溶液，將超聲探頭浸入水相中，在超聲功率300 W下處理15 min，處理結(jié)束后，3 000 r/min離心10 min，離心后的樣品溶液體系分為3 層，上層為蒸餾水，中層為乳清蛋白，下層為離子液體。除掉水相，取乳清蛋白層，回收下層離子液體，乳清蛋白層用蒸餾水洗滌、離心，反復(fù)數(shù)次以除去殘留離子液體，蛋白經(jīng)冷凍干燥后用于后續(xù)研究。

1.3.2 乳清蛋白的酶解

乳清蛋白的基本酶解條件：蛋白酶選用AP，酶解溫度55 ℃，酶解pH 8.0。

1.3.2.1 初始底物質(zhì)量濃度對乳清蛋白水解度變化的影響

在加酶量（酶比活力為60 000 U/g）為0.5 g/L條件下，研究乳清蛋白在不同底物質(zhì)量濃度（20、40、60、80、100 g/L）下分別酶解20、40、60、80、100 min后的水解度（degree of hydrolysis，DH）。

1.3.2.2 AP質(zhì)量濃度對乳清蛋白DH變化的影響

在初始底物質(zhì)量濃度為60 g/L時，研究乳清蛋白在不同AP質(zhì)量濃度（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g/L）下分別酶解20、40、60、80、100 min后的DH。

1.3.3 DH的測定

采用pH-stat法[18]測定蛋白質(zhì)的DH，按照公式（1）計算。

式中：c為NaOH溶液濃度/（mol/L）；V為消耗NaOH溶液的體積/L；α為α-NH2的解離度，為0.44；mp為底物蛋白的質(zhì)量/g；htot是底物蛋白的肽鍵總數(shù)/（meqv/g），為8.8 meqv/g。

1.3.4 乳清蛋白可控酶解動力學(xué)模型的建立

根據(jù)林偉鋒等[6]報道的方法研究乳清蛋白可控酶解動力學(xué)。依據(jù)酶反應(yīng)中間復(fù)合物學(xué)說，酶促反應(yīng)式見式（2）。

式中：E為酶；S為底物；k1和k2為正反應(yīng)速率常數(shù)/min-1；k-1為反向反應(yīng)速率常數(shù)/min-1；ES為酶-底物復(fù)合物；P為酶解產(chǎn)物。

由于反應(yīng)速率R是由不可逆反應(yīng)階段的速率來決定的，其與初始底物質(zhì)量濃度[S0]之間的關(guān)系用式（3）表示。

式中：R為反應(yīng)速率/（g/（L·min））；[S0]為初始底物質(zhì)量濃度/（g/L）；t為反應(yīng)時間/min；[ES]為酶-底物復(fù)合物質(zhì)量濃度/（g/L）。

通過方程（3）推導(dǎo)出方程（4）。

式中：[E0]為初始酶質(zhì)量濃度/（g/L）；ρ為初始酶失活質(zhì)量濃度/（g/L）；k3為限制性酶解反應(yīng)速率常數(shù)/min-1；kM為半飽和常數(shù)/（g/L）。

假設(shè)動力學(xué)參數(shù)a值為k2([E0]/[S0]-ρ)，動力學(xué)參數(shù)b值為k3kM/k2，則方程（4）可推導(dǎo)出式（5）。

依據(jù)實驗，可以得到不同酶解時間t下相應(yīng)的DH，通過回歸分析可以得到t與DH之間的對數(shù)方程，然后利用該方程確定動力學(xué)參數(shù)a和b，最后帶入方程（5）確定出乳清蛋白的酶解動力學(xué)模型。

1.3.5 抗氧化活性分析

1.3.5.1 清除DPPH自由基活性

取乳清蛋白酶解產(chǎn)物凍干粉，用去離子水配制成不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的溶液，分別取2 mL乳清蛋白酶解產(chǎn)物溶液和2 mL質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液混合均勻，在25 ℃靜置30 min，在517 nm波長處測吸光度[19]。按公式（6）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0是DPPH溶液和95%乙醇溶液混合后的吸光度；A1是DPPH溶液和乳清蛋白酶解產(chǎn)物溶液混合后的吸光度；A2是乳清蛋白酶解產(chǎn)物溶液和95%乙醇溶液混合后的吸光度。

1.3.5.2 Fe2+螯合能力的測定

將乳清蛋白酶解產(chǎn)物凍干粉用去離子水配制成不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的溶液，分別取3 mL乳清蛋白酶解產(chǎn)物溶液，依次加入0.05 mL 2 mmol/L FeCl2和0.1 mL 5 mmol/L菲洛嗪，混勻后在25 ℃反應(yīng)10 min，在562 nm波長處測其吸光度[20]。以蒸餾水代替樣品，作為空白組。按公式（7）計算Fe2+螯合率。

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣品組的吸光度。

1.3.5.3 還原力的測定

將乳清蛋白酶解產(chǎn)物凍干粉用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）配制成不同質(zhì)量濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的溶液，分別取2 mL乳清蛋白酶解產(chǎn)物溶液，加入2 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后在50 ℃反應(yīng)20 min，加入2 mL質(zhì)量分數(shù)10%三氯乙酸終止反應(yīng)，于5 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分數(shù)0.1%三氯化鐵溶液，混合均勻后靜置10 min，在700 nm波長處測定吸光度，以表示還原力[21]。

1.3.6 乳清蛋白酶解產(chǎn)物中肽分子質(zhì)量分布分析

用體積排阻色譜法分析乳清蛋白酶解產(chǎn)物中肽分子質(zhì)量分布[22]。

分子質(zhì)量標準品的配制：將不同分子質(zhì)量標準品（牛血清白蛋白、胃蛋白酶、細胞色素c、胰蛋白酶抑制劑、人血管緊張素Ⅱ、乙氨酰-乙氨酰-乙氨酸）用乙腈-水（10∶90，V/V）配制成1 mg/mL溶液，用0.45 μm聚四氟乙烯膜過濾后進樣分析。以保留時間對分子質(zhì)量對數(shù)作線性回歸，即可得到分子質(zhì)量校正曲線方程。

高效液相色譜分析條件：色譜柱：GPC/SEC-PL aquagel-OH MIXED-H（300 mm×7.5 mm，8 μm）；流動相：乙腈-水（10∶90，V/V）；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：220 nm；進樣體積：20 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗重復(fù)3 次，采用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲-離子液體處理對乳清蛋白酶解動力學(xué)的影響

2.1.1 乳清蛋白酶解動力學(xué)的建立

2.1.1.1 初始底物質(zhì)量濃度和AP質(zhì)量濃度對乳清蛋白DH的影響

圖1 不同[S0]下乳清蛋白的水解曲線Fig. 1 Hydrolysis curves of whey protein at different substrate concentrations

圖2 不同[E0]下乳清蛋白的水解曲線Fig. 2 Hydrolysis curves of whey protein at different AP concentrations

為了利用方程（5）確定乳清蛋白酶解動力學(xué)參數(shù)，研究了[S0]和[E0]對乳清蛋白DH的影響，結(jié)果如圖1、2所示。在相同酶解時間下，乳清蛋白DH隨著[S0]增大而減小（圖1），而隨著[E0]增大而增大，這表明乳清蛋白DH與加酶量（酶與底物的比率）呈正相關(guān)性，乳清蛋白DH隨著加酶量的增加而增大，這與Guo Yuxing等[23]利用乳清蛋白酶解制備ACE抑制肽時研究的結(jié)果一致。從圖1、2也可以看出，乳清蛋白在酶解100 min期間，前40 min的DH增幅較大，隨后DH增幅逐漸平緩，這可能是因為乳清蛋白酶解過程中產(chǎn)生了產(chǎn)物抑制、蛋白酶失活和酶解位點減少，最終導(dǎo)致乳清蛋白DH增幅較慢[24]。此外，與未處理乳清蛋白相比，超聲-離子液體處理后乳清蛋白DH得到了提高，比未處理組提高了3.7%～27.8%。

2.1.1.2 乳清蛋白酶解動力學(xué)模型參數(shù)

表1 [E0]和[S0]對乳清蛋白水解動力學(xué)參數(shù)a和b值的影響Table 1 Effect of enzyme and substrate concentrations on kinetic parameters a and b values for whey protein hydrolysis

利用方程（5）分別使用Origin8.0軟件對圖1、2各水解曲線進行回歸擬合，得到了[E0]和[S0]的酶解動力學(xué)參數(shù)a和b值（表1）。動力學(xué)參數(shù)a值隨著[E0]增加而明顯增大，隨著[S0]增加而明顯減小，這表明參數(shù)a值并不是一個常數(shù)。動力學(xué)參數(shù)b值很小，基本在0.09～0.16范圍內(nèi)，而且在不同[E0]和[S0]下變化不明顯，接近一個常數(shù)，相似的現(xiàn)象也在其他蛋白的酶解動力學(xué)研究中被發(fā)現(xiàn)。廖丹葵等[25]研究發(fā)現(xiàn)，藍圓鲹蛋白的酶解動力學(xué)參數(shù)b值基本保持在0.154左右；張治國等[26]研究發(fā)現(xiàn)，鰻魚蛋白的酶解動力學(xué)參數(shù)b值基本保持在0.061 9左右。因此，本研究將參數(shù)b值設(shè)定為常數(shù)，用平均值表示。最終確定未處理乳清蛋白的酶解動力學(xué)參數(shù)b值為0.137 9，超聲-離子液體處理乳清蛋白的酶解動力學(xué)參數(shù)b值為0.135 1。根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，分別對參數(shù)a值與[E0]/[S0]作圖，結(jié)果如圖3所示。參數(shù)a值與[E0]/[S0]呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，未處理乳清蛋白酶解時參數(shù)間的關(guān)系曲線為a＝133.8[E0]/[S0]-0.076（R2＝0.996）；超聲-離子液體處理乳清蛋白酶解時參數(shù)間的關(guān)系曲線為a＝166.8[E0]/[S0]-0.054（R2＝0.995）。

圖3 [E0]/[S0]值與動力學(xué)參數(shù)a的線性回歸Fig. 3 Linear regression of [E0]/[S0] value versus kinetic parameter a

從方程（4）可以看出，在蛋白酶解反應(yīng)中，a＞0是蛋白質(zhì)酶解發(fā)生的必要條件，若a≤0，則有反應(yīng)速率R≤0，蛋白酶解將不能進行[6,26]。因此，理論上未處理乳清蛋白要發(fā)生酶解反應(yīng)時，其[E0]應(yīng)高于其[Emin]，為5.68×10-4[S0]；超聲-離子液體處理乳清蛋白要發(fā)生酶解反應(yīng)時，其[E0]應(yīng)高于其[Emin]，為3.23×10-4[S0]。不同[S0]對應(yīng)的[Emin]見表2。

表2 不同[S0]對應(yīng)的臨界酶質(zhì)量濃度[Emin]Table 2 Critical enzyme concentrations [Emin] at different substrate concentrations

從表2可知，相同[S0]下，超聲-離子液體處理乳清蛋白若要發(fā)生酶解反應(yīng)時，所需的[Emin]比未處理乳清蛋白的低了約43.1%，這說明超聲-離子液體處理的乳清蛋白更易酶解。

將a與[E0]/[S0]之間的關(guān)系式以及b值帶入方程（5），得到AP酶解未處理乳清蛋白的動力學(xué)模型（8）。

得到AP酶解超聲-離子液體處理乳清蛋白的動力學(xué)模型（9）。

由方程（8）和（9）可以看出，乳清蛋白DH與[S0]、[E0]和反應(yīng)時間t密切相關(guān)；當[E0]不變時，乳清蛋白水解度隨著[S0]的升高而降低；當[S0]不變時，乳清蛋白水解度隨著[E0]升高而增加，這與圖1、2結(jié)果一致。

2.1.1.3 酶解動力學(xué)模型的驗證

為了驗證乳清蛋白處理前后的酶解動力學(xué)模型可靠性，在60 g/L底物、0.5 g/L AP、酶解溫度55 ℃和pH 8.0的條件下，利用實驗的方法測定乳清蛋白在酶解20、40、60、80、100 min時的DH，并與理論值作比較，結(jié)果如圖4所示。

圖 4 乳清蛋白水解度的理論值與實際值的相關(guān)性Fig. 4 Correlation between the predicted and experimental DHs of whey protein

從圖4可知，處理前（y＝0.900x+0.039）、后（y＝0.912x+0.063）乳清蛋白DH的實際值和理論值基本一致，且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2＝0.999），這表明所建立的酶解動力學(xué)模型可靠，能較好地模擬AP酶解乳清蛋白的酶解過程，具有良好的實際應(yīng)用價值。

2.2 DH對乳清蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

圖5 不同DH的乳清蛋白對DPPH自由基清除活性Fig. 5 DPPH radical-scavenging activity of hydrolysate from whey protein with different DHs

以DPPH自由基清除率為評價指標，研究了DH對乳清蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響（圖5）。對于未處理組和超聲-離子液體處理組來說，DH對乳清蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響趨勢一致，均隨著DH增大，乳清蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性逐漸增高，在10% DH時DPPH自由基清除率達到最高，當進一步增大DH，乳清蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性反而降低。大豆蛋白酶解產(chǎn)物[27]和麥胚蛋白酶解產(chǎn)物[28]的DPPH自由基清除活性也都具有類似的變化規(guī)律，這說明蛋白DH與其酶解產(chǎn)物自由基清除活性密切相關(guān)，只有適宜的DH才能使蛋白酶解產(chǎn)物呈現(xiàn)良好的抗氧化活性。因此，本研究選擇10% DH的乳清蛋白酶解產(chǎn)物進行后續(xù)抗氧化活性研究。

2.3 超聲-離子液體處理對乳清蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

由圖6可知，乳清蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性比VC的低；在乳清蛋白酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL時與DPPH自由基清除率呈現(xiàn)良好的正相關(guān)性，利用Excel軟件對乳清蛋白酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率進行多項式回歸，得到了未處理組、超聲處理組和超聲-離子液體處理組的回歸方程，分別為y＝-2.313x2+24.70x-0.637（R2＝0.997）、y＝-2.358x2+25.74x-0.685（R2＝0.997）和y＝-2.554x2+27.17x+0.042（R2＝0.998），各回歸方程的R2均在0.99以上，表明各回歸方程擬合程度良好。依據(jù)這些回歸方程確定了未處理組、超聲處理組和超聲-離子液體處理組乳清蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的IC50值分別為（2.77±0.02）、（2.58±0.01）、（2.37±0.02）mg/mL，超聲-離子液體處理后乳清蛋白酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性顯著提高（p＜0.05），分別比未處理組和超聲處理組高了14.4%和8.1%。

圖6 超聲-離子液體處理對乳清蛋白酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性的影響Fig. 6 Effect of ultrasound-ionic liquid treatment on DPPH radical scavenging activity of whey protein hydrolysate

圖7 超聲-離子液體處理對乳清蛋白酶解產(chǎn)物螯合Fe2＋能力的影響Fig. 7 Effect of ultrasound-ionic liquid treatment on Fe2＋ chelating capacity of whey protein hydrolysate

從圖7可知，在質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL時，乳清蛋白酶解產(chǎn)物對Fe2+螯合能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加。在3 組實驗中，超聲-離子液體處理組的Fe2+螯合能力最強，其次為超聲處理組，未處理組的Fe2+螯合能力最低。利用Excel軟件對實驗組的質(zhì)量濃度與Fe2+螯合率進行多項式回歸，得到了未處理組、超聲處理組和超聲-離子液體處理組的回歸方程，分別為y＝0.334x3-6.175x2+36.54x-0.922（R2＝0.994）、y＝0.499x3-7.877x2+41.49x-0.270（R2＝0.999）和y＝0.857x3-11.12x2+49.45x-0.707（R2＝0.996），回歸方程的R2均在0.99以上，表明各回歸方程擬合程度良好。從這些回歸方程可以得到未處理組、超聲處理組和超聲-離子液體處理組的乳清蛋白酶解產(chǎn)物螯合Fe2+的IC50值分別為（2.01±0.04）、（1.71±0.01）、（1.44±0.02）mg/mL。乳清蛋白經(jīng)超聲-離子液體處理后，其酶解產(chǎn)物的Fe2+螯合能力分別比未處理組和超聲處理組提高了28.4%和15.8%。盡管乳清蛋白酶解產(chǎn)物具有良好的Fe2+螯合能力，但低于EDTA-2Na的Fe2+螯合能力。

圖8 超聲-離子液體處理對乳清蛋白酶解產(chǎn)物還原力的影響Fig. 8 Effect of ultrasound-ionic liquid treatment on reducing power of whey protein hydrolysate

由圖8可知，未處理組、超聲處理組和超聲-離子液體處理組的乳清蛋白酶解產(chǎn)物還原力均隨著酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增大而增強，呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性。相同酶解產(chǎn)物質(zhì)量濃度下，超聲-離子液體處理組的乳清蛋白酶解產(chǎn)物還原力最強，其次為超聲處理組的乳清蛋白酶解產(chǎn)物，未處理組的乳清蛋白酶解產(chǎn)物的還原力最小。

本研究分別采用DPPH自由基清除法、螯合Fe2+法和還原力法評價乳清蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。結(jié)果表明超聲-離子液體處理后乳清蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最強。這主要是因為超聲與離子液體聯(lián)合處理能夠強化超聲處理效果，使埋藏在乳清蛋白內(nèi)部的活性部位充分暴露，更好地與酶結(jié)合，有利于酶解釋放出活性更強的抗氧化肽，從而提高了酶解產(chǎn)物的抗氧化活性[14,29-30]。

2.4 乳清蛋白酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布

由于10% DH的乳清蛋白酶解產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性，因此本研究對其分子質(zhì)量分布進行了初步研究。分子質(zhì)量分布利用體積排阻色譜法分析，以保留時間（x）和分子質(zhì)量對數(shù)值（y）進行擬合回歸，最終得到分子質(zhì)量校正曲線方程y＝-0.352x+9.159（R2＝0.962），呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可以用于分析乳清蛋白酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布。

表3 10% DH的乳清蛋白酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布Table 3 Molecular weight distribution of whey protein hydrolysate with DH of 10%%

從表3可以看出，超聲-離子液體處理顯著提高了乳清蛋白酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量＞1～5 ku的肽含量（p＜0.05），但分子質(zhì)量在＞5～10 ku之間和≤1 ku的肽含量變化不顯著（P＞0.05），這表明超聲-離子液體處理顯著提高了乳清蛋白酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量在＞1～5 ku之間的肽含量（p＜0.05）。結(jié)合上述抗氧化活性分析，可以初步推斷出超聲-離子液體處理后乳清蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性的增強可能與提高酶解產(chǎn)物中＞1～5 ku組分含量有關(guān)。

3 結(jié) 論

在酶解溫度55 ℃和pH 8.0的條件下，分別建立了乳清蛋白在超聲-離子液體處理前后的AP酶解動力學(xué)模型分別為DH＝7.25×ln（1+（18.45×[E0]/[S0]-0.010 5）×t）和DH＝7.40×ln（1+（22.53×[E0]/[S0]-0.007 3）×t）；AP酶解乳清蛋白存在[Emin]；超聲-離子液體處理后，乳清蛋白要發(fā)生酶解反應(yīng)時所需的[Emin]降低，表明超聲-離子液體處理使乳清蛋白更易酶解。

對比未處理組、超聲處理組和超聲-離子液體處理組的乳清蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)超聲-離子液體處理組的乳清蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性最強；乳清蛋白經(jīng)超聲-離子液體處理后，其酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基活性和螯合Fe2+能力分別提高了14.4%和28.4%，其酶解產(chǎn)物的還原力也得到了改善。同時，超聲-離子液體處理后乳清蛋白酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量＞1～5 ku的肽含量也顯著提高（p＜0.05）。

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Effect of Ultrasound-Ionic Liquid Treatment on Kinetics of Enzymatic Hydrolysis and Antioxidant Activities of Hydrolysates from Whey Protein

KUANG Cong1, JIA Junqiang1,2,*, WU Qiongying1,2,*, ZHANG Xuefen1, GUI Zhongzheng1,2
(1. College of Biotechnology, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212018, China;2. Sericultural Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhenjiang 212018, China)

In order to elucidate the kinetic characteristics of the enzymatic hydrolysis of whey protein that had been subjected to ultrasound-ionic liquid (UIL) treatment, the effects of initial substrate concentration, enzyme concentration and hydrolysis time on the degree of hydrolysis of whey protein were studied, and a kinetic model for the hydrolysis of whey protein by alcalase was established. In addition, the effect of UIL treatment was evaluated on antioxidant activities of whey protein hydrolysates such as 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, Fe2+chelating activity and reducing power. Results showed that UIL treatment changed the kinetic model for enzymatic hydrolysis of whey protein.After UIL treatment, the critical enzyme concentration was decreased by 43.1%, suggesting that UIL treatment could promote the enzymatic hydrolysis of whey protein. Antioxidant assays showed that UIL treatment caused a 14.4% increase in the DPPH radical scavenging activity and a 28.4% increase in the Fe2+chelating capacity of whey protein hydrolysate.Moreover, the reducing power was improved after UIL treatment. Size exclusion chromatography analysis showed that UIL treatment signif i cantly increased the ＞ 1-5 ku fraction from whey protein hydrolysate by 12.2% compared to untreated whey protein (P ＜ 0.05).

whey protein; enzymatic hydrolysis; kinetics; ionic liquid; ultrasonic treatment

10.7506/spkx1002-6630-201723006

TS201.1

A

1002-6630（2017）23-0032-07

匡聰, 賈俊強, 吳瓊英, 等. 超聲-離子液體處理對乳清蛋白酶解動力學(xué)及其產(chǎn)物抗氧化活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2017,38(23): 32-38.

10.7506/spkx1002-6630-201723006. http://www.spkx.net.cn

2016-09-28

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31401641）

匡聰（1991—），男，碩士研究生，研究方向為生物資源學(xué)。E-mail：rzkuangcong@163.com

*通信作者：賈俊強（1973—），男，副研究員，博士，研究方向為天然活性物質(zhì)的提取及生物活性。E-mail：junqiangjia2008@163.com吳瓊英（1975—），女，副教授，博士，研究方向為生物活性成分的分離提取及加工新技術(shù)。E-mail：wuqy1@163.com

KUANG Cong, JIA Junqiang, WU Qiongying, et al. Effect of ultrasound-ionic liquid treatment on kinetics of enzymatic hydrolysis and antioxidant activities of hydrolysates from whey protein[J]. Food Science, 2017, 38(23): 32-38. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723006. http://www.spkx.net.cn