盧 冰，趙嬋娟，鐘振東

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610072；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川 成都 610041)

不同清創(chuàng)法對(duì)開放性創(chuàng)口早期感染敏感指標(biāo)影響的實(shí)驗(yàn)研究

盧 冰1，趙嬋娟2，鐘振東1

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610072；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，四川 成都 610041)

目的探討不同清創(chuàng)法對(duì)開放性創(chuàng)口早期感染敏感指標(biāo)的影響。方法將96只SD大鼠隨機(jī)分為8組，除正常組外，各組用無(wú)菌手術(shù)法切除皮膚，去掉皮下組織和部分肌肉，造成基底凹凸不平的創(chuàng)面，將大腸桿菌懸濁液(細(xì)菌數(shù)>1×109個(gè)/ml) 1 ml 均勻涂于各傷口表面，使局部細(xì)菌數(shù)>1×107個(gè)。對(duì)照組傷口不予沖洗，其余各組分別用肥皂水和生理鹽水處理。分別采集1、3、7d的標(biāo)本檢測(cè)，通過ELISA、QRT-PCR和Western blot技術(shù)，觀察感染的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后與免疫因子血清降鈣素原(PCT)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和脂聯(lián)素(APN)之間的動(dòng)態(tài)變化，比較各組對(duì)開放性創(chuàng)口早期感染敏感指標(biāo)的影響。結(jié)果與正常組比較，對(duì)照組PCT、TNF-α水平同時(shí)升高，APN水平降低。各高低壓處理組均能不同程度降低PCT、TNF-α水平，升高APN水平(P< 0.01)，且高壓肥皂水沖洗組和高壓生理鹽水沖洗組術(shù)后切口早期感染發(fā)生率低于低壓肥皂水和低壓生理鹽水組(P< 0.05)。傳統(tǒng)沖洗方式組作用7d后PCT、TNF-α和APN的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。結(jié)論對(duì)于開放性創(chuàng)口早期感染敏感指標(biāo)的影響，改良沖洗的清創(chuàng)方式預(yù)防術(shù)后感染效果優(yōu)于傳統(tǒng)倒水法的清創(chuàng)方式。

清創(chuàng)；開放性創(chuàng)口；早期感染；PCT；TNF-α；APN

全球每年因創(chuàng)傷致死者約200余萬(wàn)人，傷數(shù)千萬(wàn)人[1]，其中，部分外傷會(huì)破壞皮膚的完整性，如軟組織、肌肉撕裂或挫傷，這種開放性、復(fù)雜性的骨外傷多半會(huì)伴隨感染風(fēng)險(xiǎn)，繼而導(dǎo)致傷口或骨折的延遲愈合，嚴(yán)重者甚至?xí)驗(yàn)槟摱狙Y導(dǎo)致死亡[2]。因此，開放性損傷被骨外科認(rèn)為是最需要緊急處理的。開放性損傷初期處理最重要的就是徹底的沖洗清創(chuàng)[3]，多項(xiàng)資料表明單一的沖洗方式可以在一定程度上減少傷口感染率[4]，但效果并不滿意。多數(shù)研究?jī)H是對(duì)單項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)，缺乏對(duì)綜合多項(xiàng)指標(biāo)的觀察，難以為選擇合理的沖洗液及沖洗壓力提供臨床指導(dǎo)。本研究通過大鼠開放性創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)造模，采用不同沖洗液和沖洗壓力結(jié)合的改良方式與傳統(tǒng)沖洗方式對(duì)比，探討清創(chuàng)方式對(duì)控制開放性創(chuàng)傷感染的有效作用。部分研究表明免疫因子與感染的早期診斷和預(yù)后有密切的關(guān)系[5～7]。2015～2017年我院采用ELISA、QRT-PCR和Western blot技術(shù)，觀察感染的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后與免疫因子血清降鈣素原(PCT)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和脂聯(lián)素(APN)的動(dòng)態(tài)變化，從而為感染早期如何合理有效的選擇清創(chuàng)方式，選取正確的敏感指標(biāo)和檢驗(yàn)方式提供有利的實(shí)驗(yàn)證明，為臨床早期把握感染征象，防止疾病的惡化，改善患者預(yù)后提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠96只，SPF級(jí)，雌性，體重300～400 g，單籠飼養(yǎng)，重慶第三軍醫(yī)大提供，許可證號(hào)SCXK(渝)2012-0005，每天光照與黑暗時(shí)間各12 h，動(dòng)物房溫度和濕度分別設(shè)置在20～22°C和40%～50%。所用籠具、飼料、墊料、飲水均高壓滅菌，實(shí)驗(yàn)期間的灌胃、換水、添加飼料等操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，由專人管理。

1.2藥物與試劑肥皂液每500 ml生理鹽水包中溶解15 ml肥皂；生理鹽水500 ml；沖洗器(Pulsavac，Zimmer，Dover，OH)；大腸桿菌懸濁液(細(xì)菌數(shù)>1×109個(gè)/ml)；雙蒸水；水合氯醛為分析純(批號(hào)20150513)；Total RNA 提取試劑(RNAiso Plus)；RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 TAKARA 公司)；苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)公司)；兔抗鼠 SHP 抗體(美國(guó)Bioworld公司)；ELISA 試劑盒(批號(hào) 201602，上海江萊試劑有限公司)；Stratagene熒光定量 PCR 儀(Mx3000P，美國(guó) Agilent 公司)；Abbott(雅培)Aeroset全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)雅培制藥有限公司)；聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳儀和電轉(zhuǎn)儀(美國(guó) Bio-Rad 公司)。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及造模 SD大鼠分為正常組、對(duì)照組、肥皂水組、高壓肥皂水沖洗組、低壓肥皂水沖洗組(高壓組用40psi，低壓組用14psi)、生理鹽水組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓生理鹽水沖洗組各12只。用電推剪及電剃須刀去除腹部毛發(fā)，面積約2 cm×3 cm，常規(guī)消毒后用無(wú)菌手術(shù)法切除皮膚，去掉皮下組織和部分肌肉，造成基底凹凸不平的創(chuàng)面，最深處可達(dá)骨膜外層。用大腸桿菌作為污染創(chuàng)面的細(xì)菌。將大腸桿菌懸濁液1 ml 均勻涂于各傷口表面，使局部細(xì)菌數(shù)>1×107個(gè)。

1.3.2標(biāo)本采集 分別取各組沖洗后創(chuàng)傷中心部位組織2塊約 1 cm×1 cm×1 cm，裝于EP管中，放置液氮中快速冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱凍存待做RT-PCR和Western blot。分別于實(shí)驗(yàn)后第1、3、7天按照設(shè)計(jì)的順序進(jìn)行斷尾取血，每次使用血清管(美國(guó)BD公司)取血約0.8 ml，3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液血清約0.2 ml。

1.3.3檢測(cè)指標(biāo) ①血清PCT、TNF-α和APN水平。采用放射免疫測(cè)定法測(cè)定血清PCT、TNF-α和APN的值，步驟按PCT、TNF-α和APN試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。②皮膚組織PCT、TNF-α和APN mRNA水平。Trizol法提取大鼠皮膚總RNA，分光光度法測(cè)定260 nm與280 nm的OD值，用OD260/OD280估計(jì)RNA純度(2.0左右即為RNA純品)。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR數(shù)據(jù)收集由7.0 System SDS Software軟件完成，通過軟件計(jì)算所有樣品的CT值，以相應(yīng)內(nèi)參照基因進(jìn)行校準(zhǔn)，采用2-△△CT方法對(duì)各基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量：△CT=CT(target)-CT(ref)；Avg?！鰿T(calibrator)=Avg。CT(target，calibrator)-Avg。CT(ref，calibrator)；△△CT=△CT-Avg?！鰿t(calibrator)；2-△△CT表示通過參照基因校準(zhǔn)的PCT m RNA、TNF-αmRNA、APN mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。③皮膚PCT、TNF-α和APN蛋白表達(dá)。取各組大鼠冰凍皮膚組織約100 mg，剪碎后放入1 ml RIPA 裂解液中，加入PMSF10 μl，冰上勻漿后靜置30 min，4 ℃離心12000 r/min，20 min，取上清液，BCA 法測(cè)定待測(cè)樣品的總蛋白濃度。每孔上樣量為 40 μg蛋白配置為10 μl上樣體系，SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上層5%濃縮膠，下層12%分離膠。電泳后采用 Bio-Rad Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%蛋白封閉液封閉2.5 h，TBST洗膜10 min×3次，一抗結(jié)合，4 ℃過夜；TBST 洗膜10 min×3次，二抗常溫浸泡1.5 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，Bio-Rad CCD 成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用秩和檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者采用Tamhane’sT2檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)；單向有序等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)或Ridit分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P< 0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)第1d血清PCT、TNF-α和APN的水平

從表1可知，實(shí)驗(yàn)第1d，與正常組比較，對(duì)照組PCT、TNF-α細(xì)胞因子的水平均顯著升高(P< 0.05)，APN細(xì)胞因子水平顯著降低(P< 0.05)；與對(duì)照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水沖洗組PCT、TNF-α細(xì)胞因子的水平均顯著降低P< 0.05)，APN細(xì)胞因子的水平顯著升高(P< 0.05 )。

表1 實(shí)驗(yàn)第1d各組大鼠PCT、TNF-α和APN水平 (ng/L)

*與對(duì)照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

2.2實(shí)驗(yàn)第3d血清PCT、TNF-α和APN的水平

從表2可知，實(shí)驗(yàn)第3d，與正常組比較，對(duì)照組PCT、TNF-α細(xì)胞因子的水平均顯著升高(P< 0.05)，APN細(xì)胞因子水平顯著降低(P< 0.05)；與對(duì)照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水沖洗組PCT、TNF-α細(xì)胞因子的水平均顯著降低P< 0.05)，APN細(xì)胞因子的水平顯著升高(P< 0.05 )。

表2 實(shí)驗(yàn)第3d各組大鼠PCT、TNF-α和APN水平 (ng/L)

*與對(duì)照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

2.3實(shí)驗(yàn)第3d血清PCT、TNF-α和APN的水平從表3可知，實(shí)驗(yàn)第7d，與正常組比較，對(duì)照組PCT、TNF-α細(xì)胞因子的水平均顯著升高(P< 0.05)，APN細(xì)胞因子水平顯著降低(P< 0.05)；與對(duì)照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水沖洗組PCT、TNF-α細(xì)胞因子的水平均顯著降低P< 0.05)，APN細(xì)胞因子的水平顯著升高(P< 0.05 )。

表3 實(shí)驗(yàn)第7d各組大鼠PCT、TNF-α和APN水平 (ng/L)

*與對(duì)照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

2.4大鼠皮膚組織PCT、TNF-α和APNmRNA的表達(dá)從表4可知，與正常組比較，對(duì)照組PCT、TNF-α mRNA的水平均明顯上調(diào)(P< 0.05)，APN mRNA的水平明顯下調(diào)(P< 0.05)；與對(duì)照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水組作用7d后PCT、TNF-αmRNA的水平均明顯下調(diào)(P< 0.05)，APN mRNA的水平明顯上調(diào)(P< 0.05 )。

表4 各實(shí)驗(yàn)組大鼠PCT、TNF-α和APNmRNA水平 (2-△△CT)

*與對(duì)照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

2.5皮膚組織中PCT、TNF-α和APN蛋白的表達(dá)從表5可知，與正常組比較，對(duì)照組PCT、TNF-α mRNA的水平均明顯上調(diào)(P< 0.05)，APN mRNA的水平明顯下調(diào)(P< 0.05)；與對(duì)照組比較，高壓肥皂水沖洗組、高壓生理鹽水沖洗組和低壓肥皂水沖洗組、低壓生理鹽水組作用7d后PCT、TNF-αmRNA的水平均明顯下調(diào)(P< 0.05)，APN mRNA的水平明顯上調(diào)(P< 0.05 )。

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠PCT、TNF-α和APN蛋白水平 (2-△△CT)

*與對(duì)照組比較，P< 0.05；△與肥皂水組比較，P< 0.05；▲與生理鹽水組比較，P< 0.05

3 討論

開放性創(chuàng)傷患者常常并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)，其中膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，是創(chuàng)傷患者重要的死亡原因之一。探討開放性創(chuàng)傷的感染早期敏感指標(biāo)并找到合理的清創(chuàng)模式，及時(shí)檢查出并發(fā)感染的可能，降低感染率，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)以及阻止疾病的惡化已成為外科醫(yī)生關(guān)注的重點(diǎn)。因此，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)將壓力與沖洗液的選擇進(jìn)行不同搭配組合，通過對(duì)感染指標(biāo)的檢驗(yàn)，找到最符合臨床需要的改良沖洗方式，在開放性損傷的初期就極大降低感染率。

PCT由116個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約13000，由特異蛋白酶將其剪切為降鈣素、降鈣蛋白和N2末端殘基，是降鈣素的前體物質(zhì)[8]。正常情況下甲狀腺C細(xì)胞生成分泌前降鈣素，而在其他器官組織如肝臟、肺臟、腎臟、睪丸及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和單核細(xì)胞都有PCT-I和PCT-II mRNA的表達(dá)[9]。研究認(rèn)為PCT可作為細(xì)菌早期感染的標(biāo)志物及預(yù)后指標(biāo)，PCT水平與炎癥進(jìn)展相關(guān)，PCT水平持續(xù)升高提示感染源持續(xù)存在，預(yù)后不良，經(jīng)有效治療24 h后PCT水平下降，表明治療有效，動(dòng)態(tài)觀察PCT水平變化可以監(jiān)測(cè)病情變化[10]。研究表明[11]，PCT可用于鑒別細(xì)菌及非細(xì)菌感染，也可用于明確發(fā)熱患者的病因，在自身免疫性疾病引起的發(fā)熱患者中，不伴細(xì)菌感染時(shí)，PCT水平在正常水平，當(dāng)伴細(xì)菌感染時(shí)，PCT不同水平升高，而其它炎癥因子不論在伴不伴發(fā)感染時(shí)均升高。

TNF-α被認(rèn)為是介導(dǎo)內(nèi)毒素?fù)p傷效應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)之一，過量的TNF不僅自身激活直接作用于各器官、組織、細(xì)胞誘導(dǎo)損傷，而且可誘導(dǎo)產(chǎn)生其他細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素6(IL-6)，使TNF-α的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)一步放大，而引發(fā)了一系列細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激產(chǎn)生一系列有害物質(zhì)[12]，對(duì)機(jī)體造成繼發(fā)性損傷[13，14]，是反映機(jī)體炎癥與組織損傷嚴(yán)重程度的重要敏感指標(biāo)[15]。有學(xué)者認(rèn)為嚴(yán)重創(chuàng)傷發(fā)生后，血液中炎性細(xì)胞因子相繼升高，TNF最早出現(xiàn)，并迅速達(dá)到高峰，在MODS發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過程中起了關(guān)鍵的核心作用[16]。臨床研究發(fā)現(xiàn)TNF不僅可早期預(yù)測(cè)外傷后MODS的發(fā)生，而且可以作為預(yù)測(cè)預(yù)后的標(biāo)志物，如患者血漿TNF持續(xù)高水平存在，則患者發(fā)展成MODS以致死亡的可能性很大，從而可幫助判斷預(yù)后[17]。

APN是一種由已知Acrp30、AdipQ、apM1和GBP28基因決定、脂肪細(xì)胞分泌的內(nèi)源性生物活性蛋白質(zhì)，由Scherer等[18]于1995年在小鼠3 T3-L1前脂肪細(xì)胞系的分化過程中分離克隆發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)低APN水平可能具有抑制巨噬細(xì)胞活性、抗炎癥反應(yīng)等作用，并促進(jìn)血液循環(huán)中炎性因子如TNF、IL-6等分泌增加[19]。有研究結(jié)果證實(shí)[20]：在內(nèi)毒素(LPS)誘發(fā)的大鼠膿毒血癥模型中，血漿APN濃度在注射LPS后4 h就開始出現(xiàn)下降，到24 h時(shí)降至約為正常對(duì)照組的50%。而脂肪組織中APN表達(dá)水平于注射LPS后24 h也顯著降低。通過相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：脂肪組織中APNmRNA表達(dá)水平與血漿APN水平具有高度相關(guān)性。這說(shuō)明在膿毒癥等急性炎癥反應(yīng)中也會(huì)出現(xiàn)低APN血癥，機(jī)體APN濃度的高低與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。血清APN水平降低可能是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要因素，其機(jī)制可能與降低APN對(duì)膿毒癥患者炎癥反應(yīng)的抑制作用有關(guān)，提示APN水平是反映膿毒癥病情及評(píng)價(jià)預(yù)后的一項(xiàng)重要參考指標(biāo)。

目前研究表明，感染的發(fā)生以及預(yù)后好壞與PCT密切相關(guān)，感染發(fā)生后，機(jī)體中PCT和TNF會(huì)同時(shí)升高，這點(diǎn)通過本實(shí)驗(yàn)也得到了證實(shí)；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)APN與TNF在感染發(fā)生的過程中呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但它能否直接調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子(PCT、TNF)的產(chǎn)生以及起到調(diào)節(jié)機(jī)制，目前并不清楚，有待于進(jìn)一步的深入探討。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)在感染早期就檢測(cè)PCT、TNF、APN三項(xiàng)指標(biāo)，探究了各類炎癥因子在感染早期的相互作用以及不同檢驗(yàn)方式中的表達(dá)，從而可以幫助臨床診療過程中更早的發(fā)現(xiàn)早期感染征象，同時(shí)又節(jié)約醫(yī)療資源地把握軟組織感染及壞死的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

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Experimentalstudyontheeffectofimproveddebridementmethodonsensitivemarkersforearlyinfectionofopenwound

LUbing1，ZHAOChan-juan2，ZHONGZhen-dong

(1.SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China；2.WestChinaSecondUniversityHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

ZHAOChan-juan

ObjectiveTo evaluate the effect of improved debridement method on sensitive markers for early infection of open wound.MethodsNinety-six SD rats were divided into 8 groups.Except for the normal group，the skin of each group was removed by sterile operation.Moreover，the subcutaneous tissue and part of the muscle were removed to make the uneven wound surface.One ml of Escherichia coli suspension (bacteria count >1 × 109/ml) was evenly placed on the surface of the wound in which the local number of bacteria was larger than 1 × 107.The wounds in the control group were not washed，and the rest groups were treated with soap water and physiological saline for 1 day，3 days and 7 days.The specimens were collected respectively.The positive and negative expression of APN，TNF-α and PCT were determined in the occurrence，development，prognosis of infection by using ELISA，QRT-PCR and Western blot techniques.The effects of improved debridement method on sensitive markers for early infection of open wound were compared.ResultsCompared to the normal group，the levels of TNF-α and PCT in the control group were increased and the level of APN was decreased.The levels of TNF and PCT were decreased in the high and low pressure treatment group and the level of APN was increased (P< 0.01).Furthermore，the incidence of early postoperative infection was lower in the high-pressure soap water washing group and the high-pressure saline group than that in the low-pressure soap water and the low-pressure physiological saline group (P< 0.05).After 7 days，there was no significant difference in the level of PCT，TNF-α and APN in the traditional washing method group (P> 0.05).ConclusionFor effect of open wound infection on early sensitive index，improved washing debridement method is better than traditional method for prevention of postoperative infection.

Debridement；Open Wound；Early Infection；PCT；TNF-α；APN

趙嬋娟

R641

A

1672-6170(2017)06-0071-05

2017-03-21；

2017-05-23)