楊 成， 崔梅花， 梁 君， 李 靜

北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院消化科，北京 100049

瑞巴派特對(duì)阿司匹林損傷大鼠小腸黏膜通透性的保護(hù)作用

楊 成， 崔梅花， 梁 君， 李 靜

北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院消化科，北京 100049

目的探討瑞巴派特對(duì)阿司匹林致大鼠小腸黏膜損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。方法將30只Wistar大鼠隨機(jī)平均分為空白對(duì)照組、阿司匹林損傷組和低、中、高劑量瑞巴派特保護(hù)組。采用阿司匹林150 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)14 d，瑞巴派特組在每次造模前30 min給予保護(hù)。觀察小腸黏膜組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變，檢測(cè)黏膜髓過(guò)氧化物酶(MPO)、黏蛋白2(MUC2)水平，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)，檢測(cè)血清D-乳酸水平。結(jié)果阿司匹林組小腸黏膜損傷，黏膜MPO、血清D-乳酸增加(P<0.05)，MUC2、ZO-1和Occludin表達(dá)量減少(P<0.05)，瑞巴派特可不同程度緩解以上改變。結(jié)論瑞巴派特對(duì)阿司匹林損傷小腸黏膜通透性具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能包括減輕炎癥、增加MUC2的分泌、保護(hù)細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和Occludin。

瑞巴派特；阿司匹林；緊密連接蛋白；腸黏膜通透性

以阿司匹林和吲哚美辛等為代表的非甾體類抗炎藥(NSAIDs)廣泛應(yīng)用于臨床，由其導(dǎo)致的NSAIDs相關(guān)胃腸疾病也備受關(guān)注。以往臨床主要關(guān)注胃黏膜損傷，隨著小腸疾病診斷技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多報(bào)道證實(shí)，小腸損傷也很普遍[1]。而臨床早期常常沒(méi)有明顯的癥狀，主要表現(xiàn)為亞臨床腸病，因此也容易被忽略，部分發(fā)展為嚴(yán)重并發(fā)癥才被發(fā)現(xiàn)[2]。NSAIDs致胃黏膜損傷和小腸黏膜損傷的具體機(jī)制也不一致[3]。臨床上使用質(zhì)子泵抑制劑(PPI)和H2受體拮抗劑治療通常對(duì)胃黏膜損傷有很好的保護(hù)作用，但對(duì)小腸黏膜損傷的保護(hù)作用存在一定爭(zhēng)議[4-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究瑞巴派特對(duì)阿司匹林致大鼠小腸黏膜損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑和藥物：阿司匹林(德國(guó)拜耳醫(yī)療)；瑞巴派特(浙江遠(yuǎn)力健藥業(yè)有限責(zé)任公司)；MPO和MUC2 ELISA測(cè)試盒(Cloud-Clone Corp公司)；ZO-1和Occludin一抗(Introvigen公司)；D-乳酸試劑盒(美國(guó)Biovision公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性Wistar大鼠(體質(zhì)量180～200 g)30只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于北京大學(xué)人民醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫20～25 ℃，濕度約55%，12 h晝夜循環(huán)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及干預(yù)：30只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、阿司匹林組(ASA組)、低劑量瑞巴派特組(LRG組)、中劑量瑞巴派特組(MRG組)、高劑量瑞巴派特組(HRG組)，每組6只，分籠飼養(yǎng)。阿司匹林粉末以質(zhì)量濃度為5 g/L的羧甲基纖維素鈉溶液制成懸浮液，瑞巴派特溶于生理鹽水。LRG、MRG、HRG組大鼠分別予瑞巴派特劑量為30 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg溶液1 ml灌胃，空白對(duì)照組和ASA組予等劑量生理鹽水灌胃。30 min后，LRG、MRG、HRG組和ASA組大鼠予阿司匹林劑量為150 mg/kg懸浮液1 ml灌胃，空白對(duì)照組予同樣劑量羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。以上灌胃流程持續(xù)重復(fù)14 d，于第15天在質(zhì)量濃度為20 g/L的異氟烷麻醉機(jī)(型號(hào)：MSS-3)麻醉下取材，沿腹中線剪開(kāi)，距回盲部5 cm處分別取1 cm回腸用于HE、PAS、IHC染色。

1.2.2 小腸黏膜HE染色和病理?yè)p傷評(píng)分：將小腸組織用質(zhì)量濃度為40 g/L的中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察小腸組織的病理學(xué)變化，參照Chiu腸黏膜損傷評(píng)分法進(jìn)行病理?yè)p傷評(píng)分[6]。

1.2.3 小腸黏膜PAS染色：常規(guī)質(zhì)量濃度為40 g/L的中性甲醛固定，脫水包埋，切片，蒸餾水浸洗，過(guò)碘酸溶液染色，沖洗，樣本置于Schiff Reagent染色，沖洗，蘇木素復(fù)染。光鏡下觀察。

1.2.4 緊密連接蛋白ZO-1和Occludin免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟，抗原修復(fù)，封閉，加ZO-1抗體(1∶150)或Occludin抗體(1∶150)4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗，加二抗，PBS沖洗，DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、樹(shù)膠封片。結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分[7]。

1.2.5 黏膜MPO和MUC2含量檢測(cè)：取適量小腸組織，于預(yù)冷PBS中清洗去除血液，稱重后備用。將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5～10 ml預(yù)冷PBS在冰上進(jìn)行充分研磨。得到的勻漿液反復(fù)凍融2次。將制備好的勻漿液于5 000×g離心5 min，留取上清，分別按照MPO和MUC2試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，用酶標(biāo)儀(型號(hào)：iMark)在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.2.6 小腸黏膜透射電鏡檢測(cè)：距回盲部5 cm處切取面積約1 mm3的回腸，置于質(zhì)量濃度為30 g/L的戊二醛溶液，清洗，質(zhì)量濃度為10 g/L的鋨酸固定，脫水，包埋，聚合，超薄切片，檸檬酸鉛染色，水洗干燥后透射電鏡(型號(hào)：FEI TECNAI SPIRIT)觀察，照相。

1.2.7 血清D-乳酸含量：將大鼠置于質(zhì)量濃度為20 g/L的異氟烷維持麻醉下，沿腹中線剪開(kāi)，采取下腔靜脈血3 ml于EDTA抗凝管中，2 000 r/min離心20 min，取上清液于EP管中，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。具體步驟按照D-乳酸試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定分光光度值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

2 結(jié)果

2.1瑞巴派特對(duì)阿司匹林引起小腸損傷的影響空白對(duì)照組：小腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，未見(jiàn)糜爛和潰瘍；ASA組：小腸部分絨毛脫落，可見(jiàn)壞死、糜爛及潰瘍形成，固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)；給予瑞巴派特保護(hù)后，損傷程度較ASA組有不同程度的減輕。使用Chiu評(píng)分系統(tǒng)，我們半定量評(píng)估了大鼠的損傷程度，ASA組為(4.2±0.54)明顯高于空白對(duì)照組(0.78±0.39)(P<0.05)。MRG組為(2.2±0.54)和HRG組(1.99±0.54)明顯低于ASA組(P<0.05)，LRG組(3.52±0.54)略低于ASA組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ASA組相比空白對(duì)照組，炎性指標(biāo)MPO的表達(dá)量明顯增加(13.18±3.44)ng/mg(P<0.05)。不同劑量的瑞巴派特組，MPO的表達(dá)均明顯降低(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

2.2瑞巴派特對(duì)小腸黏膜MUC2含量的影響ASA組使小腸黏膜MUC2蛋白含量(0.81±0.70)明顯減少(P<0.05)，而HRG組能夠顯著增加MUC2含量(2.34±0.92)(P<0.05)，而LRG組和MRG組沒(méi)有明顯的增加(P>0.05)。另外，通過(guò)過(guò)碘酸-雪夫染色可見(jiàn)分泌MUC2的杯狀細(xì)胞，ASA組的杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯下降，排列紊亂。而給予不同劑量的瑞巴派特保護(hù)后，杯狀細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，排列逐步恢復(fù)正常(見(jiàn)圖2)。

2.3緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的變化各組免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組緊密連接蛋白ZO-1和Occludin完整地分布于小腸黏膜上皮細(xì)胞膜，均表達(dá)為棕褐色強(qiáng)信號(hào)。ASA損傷組腸黏膜ZO-1蛋白染色評(píng)分(2.50±0.548)較空白對(duì)照組(6.33±0.516)明顯減少(P<0.05)。LRG組、MRG組和HRG組的ZO-1蛋白染色評(píng)分分別為3.50±0.548、4.50±0.837、5.83±0.983，較ASA組明顯增加(P<0.05)。ASA損傷組腸黏膜Occludin蛋白染色評(píng)分(2.00±1.095)較空白對(duì)照組(6.83±0.408)減少(P<0.05)。MRG組(4.17±0.983)和HRG組(6.50±0.548)的Occludin蛋白染色評(píng)分，較ASA組明顯增加(P<0.05)，而LRG組(2.33±0.516)與ASA組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)圖3)。

注：1：空白對(duì)照組；2：ASA組；3：LRG組；4：MRG組；5：HRG組。與1比較，aP<0.05；與2比較，bP<0.05。

注：1：空白對(duì)照組；2:ASA組；3：LRG組；4：MRG組；5：HRG組。與1比較，aP<0.05；與2比較，bP<0.05。圖2 小腸黏膜MUC2表達(dá)和PAS染色(100×) A：各組小腸MUC2蛋白的表達(dá)量；B：空白對(duì)照組；C：ASA組；D：LRG組；E：MRG組；F：HRG組Fig 2 Expression of MUC2 in small intestines and the PAS stain (100×) A: the expression of MUC2 protein in each group; B: control group; C: ASA group; D: LRG group; E: MRG group; F: HRG group

2.4小腸黏膜上皮超微結(jié)構(gòu)的改變空白對(duì)照組小腸黏膜上皮微絨毛排列整齊，上皮細(xì)胞間的緊密連接正常。給予阿司匹林后小腸黏膜的微絨毛變短、減少，排列紊亂、稀疏，細(xì)胞緊密連接間隙增寬。MRG組和HRG組微絨毛和細(xì)胞緊密連接間隙得到很大改善，接近空白對(duì)照組，而LRG組改善不明顯(見(jiàn)圖4)。

2.5腸道通透性的變化檢測(cè)血清中D-乳酸反映腸道通透性改變，在空白對(duì)照組中，血清D-乳酸的濃度為(1.58±0.48)mmol/L，而ASA組為(4.61±1.71)mmol/L，腸道黏膜受損，通透性較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。MRG組(3.50±0.90)mmol/L和HRG組(3.08±0.87)mmol/L,D-乳酸水平較ASA組明顯下降(P<0.05)，LRG組(2.12±0.83)mmol/L較ASA組無(wú)明顯減少(P>0.05,見(jiàn)圖5)。

3 討論

目前認(rèn)為，阿司匹林等NSAIDs類藥致小腸黏膜損傷的機(jī)制主要包括：一方面，阿司匹林等NSAIDs抑制環(huán)氧合酶(COX)尤其是COX-1的活性，減少了內(nèi)源性前列腺素的合成與釋放，破壞腸上皮黏膜的屏障作用[8]。另一方面，NSAIDs通過(guò)腸道、血流和膽道集聚在小腸，對(duì)小腸黏膜細(xì)胞造成刺激作用[9]。若持續(xù)接觸藥物，腸黏膜上皮細(xì)胞的通透性將會(huì)增加。正常腸道中有許多的腸道菌群，細(xì)菌分泌的內(nèi)毒素將會(huì)滲透黏膜細(xì)胞到達(dá)腸道黏膜固有層，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使炎癥細(xì)胞聚集到腸黏膜損傷部位。長(zhǎng)期使用NSAIDs通過(guò)以上可能的機(jī)制逐漸導(dǎo)致小腸黏膜潰瘍、出血、狹窄甚至穿孔。阿司匹林與其他NSAIDs致病機(jī)制不完全一致，沒(méi)有肝腸循環(huán)，其損傷程度也較小。腸黏膜通透性的增加是阿司匹林致小腸黏膜損傷的早期改變，也是其引起腸病的起始環(huán)節(jié)。

圖3 ZO-1和Occludin蛋白的免疫組織化學(xué)染色(400×) A：空白對(duì)照組；B：ASA組；C：LRC組；D：MRC組；E：HRC組

注：黑色箭頭標(biāo)記微絨毛，白色箭頭標(biāo)記上皮細(xì)胞間的緊密連接。

注：與Control組比較，aP<0.05；與ASA組比較，bP<0.05。

瑞巴派特作為黏膜保護(hù)劑由于其同時(shí)具有增加內(nèi)源性前列腺素、促進(jìn)黏液的分泌、清除黏膜上皮細(xì)胞氧自由基、促進(jìn)黏膜再生等作用，使其在防治阿司匹林等NSAIDs導(dǎo)致的腸病中被逐漸重視[10]。雖然瑞巴派特在臨床上廣泛應(yīng)用，但其對(duì)黏膜屏障影響的機(jī)制尚未闡明。腸黏膜MPO水平能代表其炎癥程度，本研究中MPO的改變與病理結(jié)果基本一致，均表明瑞巴派特能顯著減輕阿司匹林導(dǎo)致小腸黏膜損傷后的炎癥程度。

由腸黏液層、上皮細(xì)胞及其間的細(xì)胞連接復(fù)合體組成的機(jī)械屏障是抵御各種毒素、有害物質(zhì)及致病菌入侵機(jī)體的第一道且是最重要的屏障，對(duì)維持腸道正常功能起重要作用[11]。MUC2主要由杯狀細(xì)胞分泌，是構(gòu)成腸黏液層的主要物質(zhì)，是一種高度糖基化的大分子量黏蛋白，覆蓋于腸上皮細(xì)胞頂端，在潤(rùn)滑腸道、為腸內(nèi)抗菌蛋白及共生菌群提供黏附位點(diǎn)、抵御腸內(nèi)致病菌及有害物質(zhì)入侵等方面發(fā)揮著重要功能[12]?，F(xiàn)已有多種研究證實(shí)，使用阿司匹林等NSAIDs可導(dǎo)致黏液層變薄，使得腸內(nèi)細(xì)菌和毒素更加容易接觸腸上皮細(xì)胞，隨著屏障功能進(jìn)一步破壞，侵襲力也成瀑布式增加，造成惡性循環(huán)[13-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合對(duì)杯狀細(xì)胞特異性的PAS染色和MUC2定量研究表明，不同濃度的瑞巴派特能保護(hù)被阿司匹林破壞的杯狀細(xì)胞，使MUC2的表達(dá)量顯著增加，恢復(fù)一定程度腸道黏液層的完整性。

腸上皮細(xì)胞間的有多種連接，其中以緊密連接最為重要，它能封閉細(xì)胞間隙，防止腸腔有害物質(zhì)自由穿過(guò)上皮層，對(duì)調(diào)節(jié)腸道黏膜通透性起重要作用[16]。緊密連接以ZO-1和Occludin蛋白最為重要，Occludin與ZO-1相互作用后能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)途徑，改變肌動(dòng)蛋白收縮性，影響細(xì)胞間緊密連接的裝配與功能，調(diào)節(jié)其通透性[17]。在本研究中，應(yīng)用阿司匹林造模后，大鼠小腸組織中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)量均明顯下降，導(dǎo)致連接復(fù)合體破壞，腸黏膜通透性增加。而不同劑量的瑞巴派特保護(hù)組中ZO-1和Occludin表達(dá)量較損傷組明顯上調(diào)。同時(shí)，通過(guò)透射電鏡也可以看出瑞巴派特保護(hù)組中小腸黏膜上皮細(xì)胞間的縫隙也較損傷組減小，說(shuō)明瑞巴派特對(duì)阿司匹林致小腸黏膜損傷的保護(hù)機(jī)制與上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin有關(guān)，這與Lai等[18]的結(jié)果一致。

另外，本研究中選用D-乳酸水平進(jìn)一步證實(shí)了瑞巴派特對(duì)腸道黏膜通透性的改變作用。大鼠體內(nèi)D-乳酸是腸道內(nèi)細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而其他組織不產(chǎn)生D-乳酸，故血清中的D-乳酸可以認(rèn)為是來(lái)源于腸道。由于大鼠體內(nèi)缺乏代謝D-乳酸的D-乳酸脫氫酶，當(dāng)給予阿司匹林后，腸道黏膜屏障受損，腸道通透性增加，D-乳酸就能通過(guò)受損的黏膜進(jìn)入血液，所以，血液中D-乳酸的水平可以作為腸黏膜屏障損傷和其通透性改變的良好指標(biāo)[19]。本研究中ASA組中小腸黏膜通透性最高，而不同濃度瑞巴派特組黏膜通透性隨藥物濃度升高而逐漸降低，作用呈濃度依賴性，與瑞巴派特對(duì)ZO-1和Occludin的影響相一致，進(jìn)一步說(shuō)明緊密連接與細(xì)胞通透性的密切關(guān)系。

綜上所述，瑞巴派特對(duì)阿司匹林誘導(dǎo)小腸黏膜損傷有較好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能包括：在阿司匹林損傷小腸黏膜早期減輕炎癥反應(yīng)、增加黏蛋白MUC2的分泌、保護(hù)細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和Occludin，在一定程度上降低了阿司匹林誘導(dǎo)的小腸黏膜通透性的增加，保障了小腸黏膜屏障的完整性，從而防止小腸黏膜進(jìn)一步的損傷。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

ProtectiveeffectofRebamipideonthesmallintestinalpermeabilityinratswithAspirin-induced

YANG Cheng, CUI Meihua, LIANG Jun, LI Jing

Department of Gastroenterology, Peking University Aerospace School of Clinical Medicine, Beijing 100049, China

ObjectiveTo investigate the protective effect of Rebamipide on small intestinal permeability Aspirin-induced in rats and its possible mechanism.MethodsThirty Wistar rats were randomly and equally divided into control group, Aspirin-injuried group and low-dose, middle-dose, high-dose Rebamipide treated group. Rats were administered Aspirin (150·kg-1·d-1, p.o.) for 14 days except for control group. Rebamipide was given 30 min before the administration of Aspirin except for Aspirin in injuried group and control group. Small intestinal tissues were observed for histopathoclogic and ultrastructural pathology changes and expressions of MPO and MUC2 were determined by ELISA. Immunohistochemistry was used to detect the distribution and expressions of intestinal epithelial tight junction protein ZO-1 and Occludin. The expression of D-lactate was examined.ResultsAspirin produced lesions in small intestine, accompanied with the increase of MPO and D-lactate (P<0.05), with decrease of MUC2, ZO-1 and Occludin (P<0.05). Rebamipide could protect these changes to some extent.ConclusionRebamipide protects against Aspirin-induced changes of the small intestinal permeability, probably by alleviating inflammation, increasing MUC2 and protecting tight junction protein.

Rebamipide; Aspirin; Tight junction protein; Intestinal permeability

航天中心醫(yī)院特色臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展科研項(xiàng)目(YN201604)

楊成，在讀碩士，E-mail： pkuyc66@163.com

崔梅花，主任醫(yī)師，副教授，研究方向：幽門螺桿菌、胃癌發(fā)病機(jī)制及炎癥性腸病。E-mail： cuimeih@sina.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.11.016

R574.5

A

1006-5709(2017)11-1258-05

2017-01-10