楊 雷， 李 越， 李艷霞， 余世界， 王珊珊， 沈 磊

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060

論著·腸相關(guān)疾病

金絲桃苷對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎Nrf2/ARE信號(hào)通路的作用

楊 雷， 李 越， 李艷霞， 余世界， 王珊珊， 沈 磊

武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060

目的探討金絲桃苷(Hyperoside，Hyp)對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸黏膜Nrf2/ARE信號(hào)通路的影響。方法用DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠模型，實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、模型組、DSS+Hyp低劑量組(DSS+Hyp 80 mg/kg)、DSS+Hyp高劑量組(DSS+Hyp 120 mg/kg)，每組6只；質(zhì)量濃度為30 g/L的DSS自由飲水7 d制成結(jié)腸炎小鼠模型同時(shí)于造模前7 d開(kāi)始予Hyp灌胃治療，連續(xù)14 d。觀察小鼠結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)和結(jié)腸組織病理變化，Western blotting法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞核核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclearfactor-erythroid 2-rdated factor-2，Nrf-2)表達(dá)水平，RT-PCR檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織Nrf-2、超氧化物歧化酶(SOD)表達(dá)水平。結(jié)果與模型組比較，對(duì)照組、Hyp+DSS誘導(dǎo)組的結(jié)腸炎小鼠DAI降低(P<0.01)。Hyp能夠明顯改善結(jié)腸病理?yè)p傷。與模型組比較，Hyp明顯提高Nrf2的表達(dá)(P<0.05)。對(duì)照組、Hyp+DSS誘導(dǎo)組小鼠結(jié)腸SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量與模型組比較顯著升高(P<0.05)。結(jié)論Hyp對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與Nrf2/ARE信號(hào)通路有關(guān)。

金絲桃苷；潰瘍性結(jié)腸炎；Nrf2/ARE通路；抗氧化

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的一種常見(jiàn)臨床類型，具有慢性復(fù)發(fā)性非特異性腸道炎癥的特點(diǎn)。目前IBD病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，缺乏滿意的治療方法。研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激在UC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，而Nrf2/ARE通路被認(rèn)為是機(jī)體抗氧化應(yīng)激最重要的通路，與UC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。金絲桃苷(Hyperoside，Hyp)又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，屬于黃酮醇苷類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理活性。實(shí)驗(yàn)[3]發(fā)現(xiàn)在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中，Hyp能夠通過(guò)激活Nrf2，增強(qiáng)抗氧化酶的表達(dá)，具有很強(qiáng)的抗氧化作用。同時(shí)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也證明,Hyp可通過(guò)促進(jìn)Nrf2基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性[4]。因此本實(shí)驗(yàn)選用葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠建立急性UC模型，予模型小鼠灌胃Hyp進(jìn)行干預(yù)。研究Hyp對(duì)急性UC模型小鼠腸黏膜的影響及Nrf2/ARE信號(hào)通路的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)7～8周C57BL/6雄性小鼠24只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。Hyp購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。DSS購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司，兔Nrf-2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法C57BL/6小鼠24只，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、模型組、DSS+Hyp低劑量組(80 mg/kg)、DSS+Hyp高劑量組(120 mg/kg)，每組6只。除對(duì)照組外，其余各組將飲水中加入DSS粉末，制成質(zhì)量濃度為30 g/L的DSS溶液給小鼠自由飲用，連續(xù)7 d，制成結(jié)腸炎模型。造模前7 d開(kāi)始小鼠灌胃給藥，1次/d，連續(xù)14 d，Hyp溶于質(zhì)量濃度為5 g/L的羧甲基纖維素鈉中；小鼠給藥濃度按由低劑量到高劑量每次0.2 ml/10 g灌胃，按照小鼠體質(zhì)量計(jì)算藥量給藥。

1.3疾病活動(dòng)指數(shù)(diseaseactivityindex,DAI)評(píng)分及組織學(xué)評(píng)價(jià)從實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始，每天觀察并記錄各組小鼠飲食量、體質(zhì)量、糞便及活動(dòng)情況。從第7天開(kāi)始進(jìn)行DAI評(píng)分，根據(jù)大鼠的體質(zhì)量、糞便性質(zhì)和腸道出血情況評(píng)為1～4分[5]。

1.4病理檢查實(shí)驗(yàn)第15天頸椎脫臼法處死小鼠(處理前禁食1 d)，迅速取出整段結(jié)腸，用預(yù)冷的PBS沖洗干凈取病變最明顯處組織，一部分固定于質(zhì)量濃度為10 g/L甲醛，常規(guī)脫水、浸蠟、透明、包埋，5 μm切片，行HE染色。

1.5Westernblotting檢測(cè)Nrf2蛋白的相對(duì)表達(dá)量取腸組織，按說(shuō)明書提取細(xì)胞核蛋白并測(cè)定蛋白含量。Western blotting法參照文獻(xiàn)[6],采用Image J圖像分析軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與laminB 灰度值的比值反映各組細(xì)胞核Nrf2蛋白表達(dá)情況。

1.6Nrf-2、SODRT-PCR分析采用SYBR GreenⅠ熒光染料嵌合法，分別制作目的基因(Nrf-2，SOD)和管家基因(GAPDH)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的目的基因和管家基因分別定量。通過(guò)管家基因的校正，檢測(cè)各組Nrf-2、SOD目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列: Nrf-2: 5′-GAGCTAGATAGTGCCCCTGG-3′；SOD: 5′-AACCATCCACTTCGAGCAGA-3′。

2 結(jié)果

2.1小鼠一般情況和DAI造模前，各組小鼠飲食量、體質(zhì)量及活動(dòng)無(wú)明顯差異，造模開(kāi)始第3天起，模型組小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的腹瀉和血便，體質(zhì)量開(kāi)始明顯下降，飲食減少，少動(dòng)，實(shí)驗(yàn)中無(wú)動(dòng)物死亡。與模型組比較，對(duì)照組、DSS+Hyp低劑量組、DSS+Hyp高劑量組DAI評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。

表1 各組DAI評(píng)分Tab 1 The DAI of mice in different groups (±s)

注：與模型組比較，t=-34.66、-11.04、-20.41，*P<0.01。

2.2病理檢查結(jié)果對(duì)照組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞廣泛缺失，腺體大多數(shù)不完整，可見(jiàn)明顯的糜爛及潰瘍形成，炎癥細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，呈典型炎癥改變；DSS+Hyp低劑量組結(jié)腸黏膜腺體部分不完整，局部有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或隱窩破壞，DSS+Hyp高劑量組結(jié)腸黏膜腺體基本完整，局部有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或隱窩破壞，與模型組比較差異明顯(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織病理改變(HE 200×) A：對(duì)照組；B：模型組；C：DSS+Hyp高劑量組；D：DSS+Hyp低劑量組Fig 1 The pathological changes of colon in different groups(HE 200×)A: control group; B: model group; C: DSS+Hyp high dose group; D: DSS+Hyp low dose group

2.3Westernblotting檢測(cè)結(jié)果治療14 d后各組結(jié)腸細(xì)胞核Nrf2蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于模型組。與模型組比較，Hyp明顯增加Nrf2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.00，見(jiàn)圖2)。

2.4RT-PCR分析結(jié)果治療14 d后各組結(jié)腸細(xì)胞核Nrf2、SOD mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于模型組。與模型組比較，Hyp明顯增加Nrf2的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組、DSS+Hyp低劑量組、DSS+Hyp高劑量組小鼠結(jié)腸SOD mRNA的相對(duì)表達(dá)量與模型組比較顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

3 討論

UC是目前臨床治療的難點(diǎn)之一，其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，現(xiàn)認(rèn)為UC發(fā)病機(jī)制可概括為：環(huán)境因素作用于遺傳易感者，在腸道菌群的參與下，啟動(dòng)了難以停止的、發(fā)作與緩解交替的腸道天然免疫及獲得性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷、潰瘍經(jīng)久不愈、炎性增生等病理改變。因此多因素多機(jī)制參與UC的發(fā)生與發(fā)展，多項(xiàng)研究[1-2]表明，氧化損傷在UC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，Nrf2/ARE通路以啟動(dòng)ARE調(diào)控的Ⅱ相解毒酶及抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，表達(dá)相關(guān)蛋白，參與抗氧化應(yīng)激作用。

注：1：對(duì)照組，2：模型組，3：Hyp低劑量組，4：Hyp高劑量組；與對(duì)照組比較，t=1.634、4.00、5.61，*P<0.01。圖2 Hyp對(duì)小鼠腸結(jié)腸黏膜細(xì)胞核Nrf2蛋白含量表達(dá)影響 Fig 2 Effects of Hyp on the expression of nuclear Nrf2 in colorectal tissue of mice

組別只數(shù)Nrf2mRNASODmRNA對(duì)照組61.06±0.240.99±0.17**模型組60.71±0.190.53±0.14DSS+Hyp低劑量組61.39±0.30*0.83±0.12*DSS+Hyp高劑量組62.69±0.43**1.35±0.16**

注：與模型組比較，Nrf2 mRNA:t=1.39、2.72、7.99；SOD mRNA：t=3.83、2.48、6.76，*P<0.05，**P<0.01。

Nrf2/ARE通路能夠緩解炎癥相關(guān)的多種疾病，包括炎癥性腸病[7]。Nrf2是具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一[8]，Nrf2通過(guò)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域與sMaf蛋白或Jun蛋白形成異二聚體，再與抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element，ARE)相結(jié)合，從而啟動(dòng)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞對(duì)親電子及活性氧(ROS)的清除能力，在機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用[9]，研究[10]顯示，在DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型中，Nrf2的表達(dá)顯著下降，且與野生型小鼠相比，Nrf2基因缺陷小鼠DAI升高更明顯，Nrf2調(diào)控的抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶如超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、血紅素加氧酶1(HO-1)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶M1(GSTM1)，苯醌氧化還原酶(NQO1)的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，這表明Nrf2基因敲除的小鼠通過(guò)減少抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表達(dá)而對(duì)DSS誘導(dǎo)的UC有高度易感性，揭示Nrf2/ARE通路在DSS誘導(dǎo)UC中的作用[11]。

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用DSS制作的小鼠結(jié)腸炎動(dòng)物模型，在造模第3天開(kāi)始，即出現(xiàn)了體質(zhì)量降低、腹瀉和便血等癥狀，病理上出現(xiàn)腸黏膜潰瘍，充血、出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示本研究小鼠模型基本接近UC的臨床及病理表現(xiàn)。與模型組比較，灌胃Hyp后可以使UC模型小鼠的體質(zhì)量增加，大便性狀及便血明顯改善，DAI評(píng)分明顯降低，結(jié)腸病理改變明顯減輕，表明灌胃Hyp對(duì)小鼠UC有明確保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，模型小鼠腸道黏膜組織Nrf-2蛋白及Nrf-2 mRNA表達(dá)水平下降，SOD mRNA表達(dá)水平明顯降低；而給予Hyp干預(yù)可以顯著上調(diào)Nrf-2、SOD的表達(dá)水平。另外，Hyp增加細(xì)胞核Nrf-2表達(dá)，說(shuō)明其可以促進(jìn)Nrf-2核轉(zhuǎn)位進(jìn)而激活Nrf2/ARE通路，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)，達(dá)到對(duì)DSS誘發(fā)小鼠UC結(jié)腸黏膜的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)，Hyp能夠?qū)SS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型具有非常好的保護(hù)作用，能夠通過(guò)改善臨床癥狀，減弱腸道炎性反應(yīng)對(duì)結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用。同時(shí)，Hyp能夠上調(diào)Nrf-2及SOD水平，說(shuō)明Hyp可能是通過(guò)調(diào)控Nrf2/ARE通路來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的，為Hyp治療UC炎提供了新的分子機(jī)制理論。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

EffectsofHyperosideonNrf2/AREsignalingpathwayindextransulfatesodium-inducedcolitisinmice

YANG Lei, LI Yue, LI Yanxia, YU Shijie, WANG Shanshan, SHEN Lei

Department of Gastroenterology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China

ObjectiveTo investigate the effects of Hyperoside (Hyp) in dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice on Nrf2/ARE signaling pathway.MethodsColitis mice model was induced by DSS, a total of 24 healthy male mice were divided into control group, model control group, DSS+Hyp low dose group (DSS+Hyp 80 mg/kg) and DSS+Hyp high dose group (DSS+Hyp 120 mg/kg), six mice in each group. The Hyp treatment, continuous 14 days, began from one week before the experimental acute colitis which was induced by DSS with a mass concentration of 30 g/L in the drinking water of mice for 7 days. The disease activity index (DAI) and histological analysis were examined. The colorectal tissues levels of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) was detected by RT-PCR and Western blotting. The colorectal tissues level of SOD mRNA was assessed by RT-PCR.ResultsCompared with model control group，the scores of DAI in healthy control group and Hyp dose group were lower (P<0.01). Hyp significantly attenuated the colon histological damage. Compared with model control group, the expression of nucleus Nrf2 protein and the levels of Nrf2 mRNA were higher in Hyp dose group (P<0.05). The level of SOD mRNA in control group and Hyp dose group was significantly improved when compared with that in model group (P<0.05).ConclusionHyp exhibites protective effect on DSS-induced colitis mice model possibly through the Nrf2/ARE signaling pathways.

Hyperoside; Ulcerative colitis; Nrf2/ARE pathways; Antioxidant

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.11.015

楊雷，碩士研究生，研究方向：炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制及治療。E-mail: yanglei3054@163.com

沈磊，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制及治療。E-mail: leishenwuhan@126.com

R574.62

A

1006-5709(2017)11-1255-03

2017-02-10