陶明寶，鄢玉芬，張樂，陳鴻平，陳林，劉友平

·炮制制劑·

虎杖中白藜蘆醇的酶法提取工藝研究

陶明寶，鄢玉芬，張樂，陳鴻平，陳林，劉友平*

目的：優(yōu)選虎杖中白藜蘆醇的酶法提取工藝。方法：采用單因素和正交試驗，以白藜蘆醇的含量和浸膏得率為評價指標，對白藜蘆醇的酶法提取工藝進行優(yōu)化。結果：酶解法提取白藜蘆醇的最佳條件為：酶種類為纖維素酶，酶用量0.6 %，酶解pH=5.0，酶解溫度50 ℃，酶解時間36 h，酶解后的樣品加入8倍量80 %乙醇，85 ℃（藥液微沸）提取3次，每次2 h。原藥材中白藜蘆醇的含量為0.459 %，經(jīng)酶解后白藜蘆醇含量上升至1.773%，虎杖苷轉移率為93.5 %。結論：優(yōu)選的酶法提取工藝為工業(yè)化大生產(chǎn)提供了基礎。

虎杖；白藜蘆醇；酶法；提取工藝

虎杖為蓼科多年生草本植物虎杖（Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.）的干燥根及根莖，藥用歷史悠久。具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效，主治濕熱黃疸，淋濁，帶下，風濕痹痛，癰腫瘡毒，水火燙傷，經(jīng)閉，癥瘕，跌打損傷，肺熱咳嗽[1]?，F(xiàn)階段虎杖中的化學成分研究已經(jīng)比較深入[2-3]，虎杖中的化學成分主要有茋類化合物、蒽醌類化合物、黃酮類化合物、水溶性多糖、鞣質等成分[4]。以白藜蘆醇為代表的茋類化合物具有抗菌、抗炎、 抗腫瘤、抗血栓、抗高血脂及抗氧化等活性[5-8]，被廣泛用于藥品、保健品、化妝品及食品添加劑等行業(yè)[9-11]。

目前常用于白藜蘆醇提取的方法有有機溶劑提取法、超聲波提取法、微波輔助提取、超臨界CO2萃取技術、酶解法等。研究表明，有機溶劑提取法操作簡便易行、生產(chǎn)成本低，但溶劑消耗量較大、受熱時間較長且提取效率不高[12-13]。超聲波提取法其產(chǎn)生的空化現(xiàn)象能夠加速藥材中有效成分的溶出，但超聲波提取法尚處于實驗室小規(guī)模研究階段，不能用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[14-16]。微波輔助提取法具有選擇性高、操作時間短等優(yōu)點，但微波輔助提取法具有明顯的熱效應且微波泄漏對工作者的身體危害較大[17]。超臨界CO2萃取法具有高效、耗能少、綠色環(huán)保等優(yōu)勢，但技術含量要求較高，設備運行成本大，故很難投入大工業(yè)化生產(chǎn)[18]。采用酶解法提取虎杖中的白藜蘆醇，其提取效率較高，但目前的酶解提取工藝中提取藥材多為過篩虎杖細粉，工業(yè)化生產(chǎn)成本較高，提取溶劑為甲醇、丙酮等毒性較大的溶劑，易造成污染[19-22]。

綜上，工業(yè)上對虎杖中的白藜蘆醇開發(fā)力度較大，但現(xiàn)行的工藝和方法存在著含量低、生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)成本相對較高、易造成資源浪費和環(huán)境污染等問題。酶解法能將白藜蘆醇苷轉化成白藜蘆醇，從而有效提高白藜蘆醇的產(chǎn)率且具有條件溫和、反應產(chǎn)物較為單一、提取效率高、不易造成有限資源浪費和污染的特點[23-25]。本試驗擬在目前酶解法研究的基礎上，繼續(xù)優(yōu)化酶解法提取工藝，使其具有耗能少、高效、綠色環(huán)保、操作簡便易行、生產(chǎn)成本低的優(yōu)勢，為酶解法提取虎杖中白藜蘆醇的工藝產(chǎn)業(yè)化提供基礎。

1 儀器與材料

YP1002電子天平（上海越平科學儀器有限公司），SQP型1/1萬電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司），PHS-3C型酸度計（上海越平科學儀器有限公司），HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），UPT-I-10T優(yōu)普系列超純水器（成都超越科技有限公司），Agilent 1260 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），L-550臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。白藜蘆醇對照品（11535-200502，供含量測定用，20 mg，中國藥品生物制品檢定所），虎杖提取用酶、纖維素酶（寧夏和氏璧生物技術有限公司），試劑均為分析純。虎杖藥材購自四川省巴中市，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學嚴鑄云教授鑒定為蓼科屬植物虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）的干燥根和根莖。

2 方法與結果

2.1 白藜蘆醇的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil-C18（200*4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.05 %磷酸水溶液(30∶70)；檢測波長：305 nm；流速：1 mL?min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液配制 取白藜蘆醇對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1004 mg的溶液，即得。

2.1.3 白藜蘆醇含量測定 取虎杖粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，稱定重量，在920 W下超聲1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾渣重復提取1次，合并提取液，取續(xù)濾液，即得。按“2.1.1”色譜條件測得白黎蘆醇的含量為0.459 %，虎杖苷的含量為3.541 %。

2.1.4 標準曲線的制備 精密吸取白藜蘆醇對照品溶液1，5，10，15，20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，記錄色譜峰面積的積分值，以白藜蘆醇進樣量(μg)為橫坐標（X），以測得峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線?；貧w方程為Y=7488.2X+28.986，r=0.9996，線性范圍為0.1004～2.0080 μg。

2.1.5 精密度實驗 在“2.1.1”項色譜條件下精密吸取同一濃度的白藜蘆醇對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積積分值，計算精密度。RSD為0.056 %，表明進樣精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗 取同一樣品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h測含量，結果樣品在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為0.13 %。

2.1.7 重復性實驗 精密稱取同一批虎杖粉末6份，每份0.5 g，按“2.1.3”項下方法制備和“2.1.1”項下色譜條件進行測定，RSD為1.2 %。

2.1.8 加樣回收率 精密稱取已知白藜蘆醇含量的虎杖粉末6份，每份0.25 g，精密加入濃度為0.4200 mg?mL-1白藜蘆醇對照品溶液4 mL，按“2.1.3”項下方法制備和“2.1.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率。白藜蘆醇的平均回收率為103.1 %，RSD為2.3 %。見表1。

表1 加樣回收率

2.2 計算

白藜蘆醇的含量（%）=（白藜蘆醇的質量/虎杖的質量）×100 %

浸膏得率（%）=（浸膏的質量/虎杖的質量）×100 %

虎杖苷轉移率（%）=（被水解的虎杖苷的質量/虎杖藥材中虎杖苷的質量）×100 %

2.3 白藜蘆醇酶解工藝的優(yōu)選研究

2.3.1 酶種類的篩選 目前，用于提取白藜蘆醇的酶主要有纖維素酶、β-葡萄糖苷酶及多種復合酶。酶解法提取工藝中，纖維素酶酶解白藜蘆醇提取率較高，應用廣泛[20-21]，復合酶中虎杖提取用酶白藜蘆醇提取率較高[26]。故本試驗主要比較纖維素酶、虎杖提取用酶和不加酶對白藜蘆醇含量的影響。取虎杖粗粉50 g，依次為不加酶、加入藥材質量0.3 %的纖維素酶、加入藥材質量的0.3 %的虎杖提取用酶，所有樣品均分別加入200 mL用鹽酸調(diào)pH=5.0的酸水，50 ℃水浴酶解2 h，酶解后的樣品進行醇提。醇提部分：酶解后的樣品均分別加入8倍量80%乙醇，50 ℃水浴提取2 h，先粗過濾，再離心（3000 r?min-1，10 min），離心后得提取液。精密吸取2 mL提取液用甲醇稀釋定容至10 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，按“2.1.1”項下色譜條件測定白藜蘆醇的含量，計算白藜蘆醇的含量；精密吸取20 mL提取液至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，105 ℃烘箱烘至恒重，即得浸膏重量，計算浸膏得率。結果見表2。

表2 酶種類的篩選（n=3）

由表2可知，酶解法白藜蘆醇含量及浸膏得率明顯高于不加酶的樣品，故選擇酶解法；其次，纖維素酶比虎杖提取用酶的白藜蘆醇含量和浸膏得率高，故在此試驗條件下，最佳的酶種類為纖維素酶。

2.3.2 酶用量的篩選 取虎杖粗粉50 g，依次加入藥材質量的0.1 %、0.3 %、0.6 %、1.0 %的纖維素酶，所有樣品均分別加入200 mL用鹽酸調(diào)pH=5.0的酸水，50 ℃水浴酶解2 h，酶解后的樣品按“2.2.1”項下醇提部分處理，結果見表3。

表3 酶用量的篩選（n=3）

由表3可知，白藜蘆醇含量和浸膏得率隨著酶用量的增加先增大后下降，當酶用量為0.6 %時達到最大值，故在此試驗條件下，最佳的酶用量為藥材質量的0.6 %。

2.3.3 酶解溫度的篩選 取虎杖粗粉50 g，加入藥材質量0.6 %的纖維素酶，所有樣品均分別加入200 mL用鹽酸調(diào)pH=5.0的酸水，依次分別30、40、50、60℃水浴酶解2 h，酶解后的樣品按“2.2.1”項下醇提部分處理，結果見表4。

表4 酶解溫度的篩選（n=3）

由表4可知，白藜蘆醇含量和浸膏得率隨著溫度的升高先增大后下降，當溫度為50 ℃時達到最大值，故在此試驗條件下，最佳的酶解溫度為50 ℃。

2.3.4 酶解pH值的篩選 取虎杖粗粉50 g，加入藥材質量的0.6 %的纖維素酶，依次分別加入200 mL用鹽酸調(diào)pH=4.0、pH=4.5、pH=4.8、pH=5.0、pH=5.5的酸水，50 ℃水浴酶解2 h，酶解后的樣品按“2.2.1”項下醇提部分處理，結果見表5。

表5 酶解pH值的篩選（n=3）

由表5可知，白藜蘆醇含量和浸膏得率隨著pH值的升高先增大后下降，當pH=5.0時達到最大值，故在此試驗條件下，最佳的酶解pH=5.0。

2.3.5 酶解時間的篩選 取虎杖粗粉50 g，加入藥材質量的0.6 %的纖維素酶，所有樣品均分別加入200 mL用鹽酸調(diào)pH=5.0的酸水，依次50 ℃水浴酶解1、2、4、6、12、24、36、42、48 h，酶解后的樣品按“2.2.1”項下醇提部分處理，結果見表6。

表6 酶解時間的篩選（n=3）

由表6可知，白藜蘆醇的含量隨酶解時間的增加先增大后下降，浸膏得率隨酶解時間的增加逐漸增大，在12 h至48 h時，浸膏得率變化不大，當酶解時間為36 h時，白藜蘆醇含量達到最大值，故在此試驗條件下，最佳的酶解時間為36 h。

2.4 白藜蘆醇醇提工藝的優(yōu)選研究

2.4.1 醇提溫度的篩選 白藜蘆醇為二苯乙烯類化合物，難溶于水，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機溶劑[27]。乙醇與其他有機溶劑相比較，具有安全、廉價、綠色環(huán)保的優(yōu)勢，結合大工業(yè)生產(chǎn)的實際情況，故選擇乙醇作為提取溶劑。取虎杖粗粉50 g，加入藥材質量的0.6 %的纖維素酶，所有樣品均分別加入200 mL用鹽酸調(diào)pH=5.0的酸水，50 ℃水浴酶解36 h，酶解后的樣品均分別加入8倍量80%乙醇，依次50、60、70、85 ℃（微沸狀態(tài)）提取2 h，先粗過濾，再離心（3000 r?min-1，10 min），得提取液。取2 mL提取液用甲醇稀釋定容至10 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得，按“2.1.1”項下色譜條件測定白藜蘆醇的含量，計算白藜蘆醇的含量；精密吸取20 mL提取液至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，105 ℃烘箱烘至恒重，即得浸膏重量，計算浸膏得率。結果見表7。

表7 醇提溫度的篩選（n=3）

由表7可知，當醇提溫度為85 ℃藥液呈微沸狀態(tài)時，白藜蘆醇的含量和浸膏得率達到最大值，故在此試驗條件下，最佳的醇提溫度為85 ℃。

2.4.2 正交試驗設計 取虎杖粗粉50 g，加入藥材質量的0.6 %的纖維素酶，所有樣品均分別加入200 mL用鹽酸調(diào)pH=5.0的酸水，50 ℃水浴酶解36 h，酶解后的樣品進行醇提工藝試驗研究，醇提溫度為85℃，選取4個因素：A乙醇濃度（%）、B乙醇用量（倍）、C提取時間、D提取次數(shù)，每個因素設3個水平，選用L9(34)正交表，以白藜蘆醇含量（%）為指標進行試驗。因素水平見表8，試驗安排及結果見表9，方差分析見表10。

表8 虎杖藥材中白藜蘆醇醇提工藝正交試驗因素水平

表9 虎杖藥材中白藜蘆醇醇提工藝正交試驗安排及直觀分析

K34.891 4.876 4.958 5.288 R0.193 0.096 0.104 0.920

表10 白藜蘆醇提取量方差分析

由直觀分析可知，影響虎杖中白藜蘆醇含量的因素順序為D＞A＞C＞B。方差分析結果表明因素C，P＜0.05，具有顯著性影響，故選擇C3；因素A、B和D，P＞0.05，無顯著性影響，結合大工業(yè)生產(chǎn)的實際情況，節(jié)約經(jīng)濟成本，故選擇A2，B1，D3。對浸膏得率進行方差分析，結果表明因素A、B、C和D，P＞0.05，均無顯著性影響。綜上，確定最優(yōu)工藝條件為A2B1C3D3，即用8倍量80%乙醇提取3次，每次2 h。

2.5 驗證試驗

稱取虎杖粗粉3份，按本實驗條件下最佳提取工藝進行驗證試驗，結果白藜蘆醇含量分別為1.766 %，1.775 %，1.779 %，平均含量為1.773 %，RSD值為0.39 %，說明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行。

3 結論與討論

虎杖中白藜蘆醇酶法提取的最佳工藝為：取虎杖粗粉50 g，加入藥材質量的0.6 %的纖維素酶，再加入200 mL用鹽酸調(diào)pH=5.0的酸水，50 ℃水浴酶解36 h，酶解后的樣品加入8倍量80%乙醇，85 ℃（藥液微沸）回流提取3次，每次2 h。

傳統(tǒng)的滲漉法、浸提法等具有操作簡便易行、生產(chǎn)成本低的優(yōu)點，但其在提取過程中費時長、溶劑用量大、浸液雜質多且提取率較低，而本試驗優(yōu)化的白藜蘆醇酶解法提取工藝具有溶劑用量少（8倍量乙醇）、操作簡便、高效、含量（1.773 %）相對較高的優(yōu)勢。

本實驗在酶解工藝的優(yōu)選中，研究發(fā)現(xiàn)酶解時間對白藜蘆醇含量的影響較為顯著，隨著酶解時間的延長，白藜蘆醇含量上升幅度較大，當酶解時間為36 h時，白藜蘆醇含量達到最大值，繼續(xù)增加酶解時間，白藜蘆醇含量變化不大。原因是隨著酶解時間的延長，纖維素與細胞壁接觸充分，內(nèi)容物溶出率增加；其次虎杖苷在纖維素酶的作用下被轉化成白藜蘆醇。目前，虎杖中白藜蘆醇的提取工藝中多采用乙酸乙酯、甲醇、丙酮等有毒、易污染環(huán)境的有機試劑，且白藜蘆醇提取含量仍較低。而本試驗采用了安全、無毒、易回收的乙醇作為提取溶劑，具有節(jié)約經(jīng)濟成本、產(chǎn)品安全、綠色環(huán)保的優(yōu)勢。

目前酶解法所采用的酶種類較多，本試驗在前人研究的基礎上篩選出了酶解效果較好的纖維素酶和虎杖提取用酶，并進行了進一步的比較研究，結果纖維素酶的酶解效果較好；酶的說明書中酶解條件概括較為籠統(tǒng)，無最佳酶解條件，本試驗結合說明書和實際情況對酶解條件進行了優(yōu)化，使其既能發(fā)揮酶的最大效率又能適應大工業(yè)化生產(chǎn)。綜上，本試驗所優(yōu)化的白藜蘆醇酶法提取工藝是工業(yè)化生產(chǎn)白藜蘆醇較為適宜的方法。

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Optimization of enzymatic process of resveratrol in Huzhang

/TAO Ming-bao, YAN Yu-fen, ZHANG Le, CHEN Hongping, CHEN Lin, LIU You-ping//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:The paper was to optimize the extraction process of resveratrol from Huzhang by enzymatic method.Method:The enzymatic extraction process of resveratrol was optimized by single factor and orthogonal test. The content of resveratrol and the yield of extract were used as evaluation indexes.Result:The optimal conditions for the extraction of resveratrol by enzyme digestion were as follows∶ 0.6 % cellulose, enzymolysis pH 5.0, temperature 50 ℃, time 36 h. Sample after enzymolysis was added 8 times 80 % ethanol and extracted 3 times (2 h each time) at 85 ℃ water bath. The content of resveratrol in Huzhang was 0.459 %, and the content of resveratrol increased to 1.773 % after enzymolysis. The translocation rate of polydatin was 93.5 %.Conclusion:The optimized enzymatic extraction process provides the basis for industrialized production.

Huzhang; resveratrol; enzymatic method; extraction process

R 283

A

1674-926X(2017)06-009-05

四川省中醫(yī)藥管理局扶貧項目(31966501)

成都中醫(yī)藥大學 藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 611137）

陶明寶（1992-），女，在讀碩士，從事中藥化學成分與質量標準化研究。Tel∶18728431648 Email∶2587578725@qq.com

劉友平（1964-），女，博士生導師，從事中藥化學成分與質量標準化研究。Tel∶(028)61800103 Email∶ liuyouping@163.com

2017-06-06

（責任編輯：何瑤）