向采芹， 馮建安， 李希,*， 黃嫣， 周方

·炮制制劑·

解毒退熱顆粒的質(zhì)量標準研究

向采芹1， 馮建安2， 李希1,2*， 黃嫣2， 周方1

目的：對退熱解毒顆粒進行質(zhì)量標準研究。方法：采用薄層色譜法對制劑中黃芩，葛根，重樓，青蒿等藥味進行定性鑒別，采用高效液相色譜法對制劑中主要有效成分黃芩苷進行定量鑒別。結(jié)果：薄層色譜鑒別顯示顆粒與黃芩，重樓等四味對照藥材或者對照品在相同位置顯示相同顏色的斑點或熒光斑點，陰性無干擾。高效液相色譜結(jié)果顯示在在0.0118～0.118 mg?mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為100.24%。結(jié)論：該方法專屬性強，穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好，可用于對解毒退熱顆粒的質(zhì)量控制。

解毒退熱顆粒；質(zhì)量標準；薄層色譜；高效液相色譜

解毒退熱顆粒是四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所兒科主任根據(jù)多年臨床的經(jīng)驗方。處方是由黃芩、柴胡、重樓、葛根等中藥制成的治療風(fēng)熱挾濕證型的小兒外感發(fā)熱的中藥復(fù)方制劑。

具有解毒退熱，定驚化濕之功效，不僅退熱效果好，且針對小兒心常有余，肝常有余，高燒易驚厥的病理特征有明顯的治療作用，無明顯的毒副作用。黃芩具有抗病毒抗菌、抗氧化、抗腫瘤等一系列藥理作用[1]。

本實驗對溶液制備進行了優(yōu)化，同時對黃芩等藥味的薄層色譜鑒別方法進行改進，為顆粒制劑的質(zhì)量控制和其指量標準的制定提供了可靠依據(jù)，保證了臨床用藥的合理，安全，高效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與設(shè)備

AgiLent-1260 高效液相色譜儀 ( 美國安捷倫科技有限公司)；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器 ( 昆山市超聲儀器有限公司)；BT-125D 型電子天平 ( 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；CS101 電熱鼓風(fēng)干燥箱 ( 重慶實驗設(shè)備廠制造)；電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；LK-1000A500 g 搖擺式高速中藥粉碎機 ( 浙江溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠制造)。GoodLook-1000型薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?/p>

1.2 試藥

試藥：黃芩苷對照品（批號：110715-201318，中國食品藥品檢定研究院），重樓對照藥材（批號：110712-201316，中國食品藥品檢定研究院），葛根素對照品（批號：110752-201313，中國食品藥品檢定研究院，青蒿對照藥材（批號：110714-201319，中國食品藥品檢定研究院）；黃芩，重樓，葛根，青蒿藥材飲片（四川省中藥飲片有限責(zé)任公司）。

試劑：乙醚，乙酸乙酯，丁酮，甲酸，無水乙醇，石油醚，三氯甲烷為分析純，5%三氯化鐵乙醇溶液，10%硫酸乙醇溶液，甲醇，磷酸為色譜純（美國 fi sher公司），水為超純水（自制）。

2 薄層色譜定性色譜鑒別

2.1 黃芩的薄層色譜鑒別

取解毒退熱顆粒5 g，加乙醚30 mL，超聲提取15 min，揮干乙醚，殘渣加家甲醇30 mL，超聲提取30 min，過濾得濾液加15 mL水調(diào)節(jié)pH值為1-2，用20 mL乙酸乙酯萃取兩次，合并萃取液，將萃取液蒸干，殘渣加2 mL甲醇溶液作為供試品。另取缺黃芩的顆粒按上述方法制成陰性供試品。再取黃芩苷對照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法實驗，吸取上述供試品溶液及對照品溶液各5 uL，分別點于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑[2]，預(yù)飽和15 min，上行展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，在日光下檢視。供試色譜中，在與對照品相同位置顯示相同暗綠色斑點，陰性樣品無斑點，見圖1。

圖1 黃芩薄層色譜鑒別

2.2 青蒿的薄層色譜鑒別

取本品顆粒5 g，加甲醇30 mL，超聲提取15 min，濾過，將濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1mL溶解，作為供試品溶液。取缺青蒿的顆粒5 g，按同法制成陰性供試品溶液。另取青蒿對照藥材1 g，加50 mL水回流提取30 min，濾過，濾液蒸干殘渣加30 mL甲醇，超聲提取15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。按照薄層色譜法，吸取上述三種試液各2-3 μL，分別點于同一以0.4% 羧甲基纖維素鈉為粘合劑的，硅膠G薄層板上，以石油醚（60-90）-乙醚（1∶4）為展開劑[3]，飽和30 min，上行展開，取出，晾干至紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相對應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點，見圖2。

圖2 青蒿薄層色譜鑒別

2.3 葛根的薄層色譜鑒別

取本品顆粒5 g，加甲醇30 mL，超聲30 min,濾過，濾液蒸干殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按照同法取不含葛根的顆粒，制成陰性供試品溶液。另取葛根素對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗，在吸取上述三種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）為展開劑，飽和30 min，上行展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏5 min，置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相對應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點，見圖3。

圖3 葛根薄層色譜鑒別

2.4 重樓的薄層色譜鑒別

取本品顆粒5 g，加乙醇10 mL，加熱回流30 min,濾過，濾液作為供試品溶液。按照同法取不含重樓的顆粒，制成陰性供試品溶液。另取重樓對照藥材，同上述方法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗，在吸取上述三種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶5∶1）為展開劑，飽和30 min，上行展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別置紫外燈（365 nm）和日光下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相對應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的褐色斑點和熒光斑點，見圖4。

圖4 重樓薄層色譜鑒別

3 黃芩苷的含量測定

3.1 色譜條件

AgiLent 1260型高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器，色譜柱Shim-pack VP-ODS C18柱（4.6×150 mm，5 um）；流動相為甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）[4]；流速：1 mL?min-1；柱溫25 ℃；紫外檢測波長：280 nm。

3.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化

3.2.1 提取方法的選擇 取本品（批號：160201）約0.5 g各2份，精密稱定，加70%乙醇適量，分別采用回流30分鐘及超聲處理30分鐘，回流所測得的黃芩苷的含量為24.357 mg?g-1，超聲處理所測得的黃芩苷含量為25.013 mg?g-1。結(jié)果表明，超聲處理和回流提取的結(jié)果差異不大，比較而言，超聲處理較回流提取方便，因此，本文選用超聲處理方法。

3.2.2 超聲時間的選擇 取本品（批號：160201）約0.5 g各2份，精密稱定，加70%乙醇適量，分別超聲處理（超聲功率300W，頻率50kHz）15分鐘、30分鐘、45分鐘，分別對應(yīng)的黃芩苷的含量為21.054、25.021、25.249 mg?mL-1。結(jié)果表明，不同超聲處理時間對結(jié)果有一定影響。超聲處理30分鐘，供試品中的黃芩苷已基本提取完全，因此，本文選用超聲處理30分鐘。根據(jù)以上結(jié)果，確定供試品制備方法為：取本品約0.5 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加70%乙醇適量，超聲提取30分鐘，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，離心，精密量取上清液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

3.3 標準曲線的繪制

對照品溶液的制備：取在60 ℃減壓干燥4小時的黃芩苷對照品5.90 mg（批號：110715-201318），于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.590mg?mL-1的對照品儲備液。精密吸取一定量的儲備液，并分別稀釋至濃度為0.0118 mg?mL-1、0.0236 mg?mL-1、0.0354 mg?mL-1、0.0472 mg?mL-1、0.059 mg?mL-1、0.118 mg?mL-1的對照品溶液，即得。照高效液相色譜法試驗，分別精密吸取上述黃芩苷對照品溶液10μL注入高效液相色譜儀，照上述色譜條件測定峰面積，外標法計算黃芩苷的含量。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，黃芩苷對照品的濃度（X）（mg?mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為 y = 29 164x - 19.612，r=0.9995結(jié)果表明：在0.0118～0.118 mg?mL-1范圍內(nèi)，黃芩苷峰面積積分值與進樣量的線性關(guān)系良好。

3.4 陰性干擾的判斷

陰性樣品溶液的制備：取缺黃芩的陰性樣品0.5 g，按供試品溶液的制備項下方法同法制成陰性樣品溶液。將陰性樣品溶液、樣品溶液、對照品溶液分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果陰性樣品在黃芩苷峰處無干擾，結(jié)果如圖1。

圖5 黃芩苷對照品（A）；供試樣品（B）；陰性供試品（C）

3.5 精密度試驗

精密吸取對照品和供試品溶液(濃度為0.059 mg?mL-1)各10 μL，連續(xù)進樣6次，測定黃芩苷的峰面積，結(jié)果對照品的平均峰面積為1 693.41，RSD值為0.76%。供試品的平均峰面積為1 411.54，RSD值為1.41%。以上結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液的精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取對照品溶液和供試品溶液10 μL分別于0小時、4小時、8小時、12小時、24小時、48小時，注入高效液相色譜儀，測定黃芩苷的峰面積，結(jié)果對照品溶液的平均峰面積為1 169.45，RSD值為0.46%，供試品溶液的平均峰面積為1 412.46，RSD值為1.48%。結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液均在48小時內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 重復(fù)性試驗

對同一批樣品取樣6份，分別按前述供試品溶液的制備方法及色譜條件進行測定，測得的黃芩苷的平均含量為25.07 mg?g-1，RSD值為1.31%。結(jié)果表明，本法具有良好的重復(fù)性。

3.8 回收率試驗

取已知含量的樣品約0.25 g，分別加入黃芩苷對照品適量，按前述供試品溶液的制備方法及色譜條件進行測定，結(jié)果見下表2。

表2 回收率試驗結(jié)果

回收率的計算公式為：

以上試驗結(jié)果表明：本法回收率良好。

3.9 耐用性試驗

取樣品，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，使用不同品牌色譜柱（分別為Shim-pack VP-ODS柱（150×4.6 mm，5 μm）；AgiLent ZORBAX SB C18柱（4.6×150 mm，5 um）），進行耐用性試驗，結(jié)果黃芩苷的含量分別為25.068、25.138 mg?g-1。

3.10 樣品的測定及含量限度的確定

取三批中試樣品，按前述擬定的含量測定方法進行測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品中黃芩苷的測定結(jié)果（n=2）

根據(jù)以上測定結(jié)果，考慮到藥材的來源及藥材中黃芩苷含量差異，以及制劑生產(chǎn)、貯藏等因素，故本標準暫定本品每袋含黃芩以黃芩苷（C21H18O11）計，不得少于180 mg。

4 討論

在退熱解毒顆粒的薄層色譜定性鑒別過程中，不僅對其主要功效的黃芩做定性鑒別，還對葛根，青蒿，從樓等藥味做了定性鑒別，鑒別過程中，根據(jù)藥典方法對四味藥進行鑒別，其中葛根，青蒿，重樓三味藥的藥典方法穩(wěn)定可行，黃芩可能受溫度、濕度、和藥物本身的影響，結(jié)果不太理想，因此本文在查閱大量相關(guān)文獻進行不斷試驗，最終確定本文中所述的黃芩的薄層色譜的鑒別方法。

對于解毒退熱顆粒的含量測定，因黃芩苷為其主要成分，穩(wěn)定且分離度較高，本文選取黃芩苷作為指標，在參照中國藥典所給黃芩苷含量測定的方法，最終本文確定了將藥典的流動相比例更改為甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），能達到更好的分離效果，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均較好。在樣品處理過程中進行了方法的優(yōu)化制訂了相對而言高效經(jīng)濟的處理方案，最終制定了解毒退熱顆粒的定性和定量的測定方法。本文所述研究方法簡便可行，薄層色譜定性研究斑點清晰，專屬性強；高效液相定量鑒別重復(fù)性好，結(jié)果準確，故方法可行，具有實際意義。

[1] 宋琳莉,孟慶剛. 黃芩的藥理作用研究進展[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2008,(08)∶1676-1678.

[2] 王野. 小兒感冒寧糖漿的薄層鑒別及黃芩苷的含量測定[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2006,(02)∶59-64.

[3] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[S].北京∶中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[4] 喬莉. HPLC法測定八寶驚風(fēng)散中黃芩苷的含量[A]. 中國藥學(xué)會、江蘇省人民政府.2012年中國藥學(xué)大會暨第十二屆中國藥師周論文集[C].中國藥學(xué)會、江蘇省人民政府,2012,6.

Quality standard of Jiedu Tuire Granules

/XIANG Cai-qin1, FENG Jian-an2, LI Xi2, HUANG Yan2, ZHOU Fang1//(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan;2.Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences, Institute of TCM, Chengdu 610031, Sichuan.)

Objective:To study the quality standard of Jiedu Tuire Granules.Method:The pharmacological properties of Huangqin, Gegen, Chonglou and Qinghao were identified by thin layer chromatography. The main active ingredient baicalin was quantitatively identified by high performance liquid chromatography (HPLC).Result:Thin layer chromatography showed that the granules were stained with the same color spots or fl uorescent spots in the same position as Huangqin and Chonglou etc.The results showed that the linearity was good in the range of 0.0118 ～ 0.118 mg?mL-1. The average recovery was 100.24%.Conclusion:The method is specific, stable, reliable and reproducible. And it can be used to control the quality of Jiedu Tuire Granules.

Jiedu Tuire Granules; quality standard; thin layer chromatography; high performance liquid chromatography

R 283.6

A

1674-926X(2017)06-010-04

四川省科研院所科技成果轉(zhuǎn)化資金(項目編號：14010138)

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610072；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，四川 成都 610031

向采芹，女，1992年出生，碩士研究生，研究方向：中藥新劑型，新技術(shù)，新工藝的研究Tel∶15809299482 Email∶742426178@qq.com

李希，女，1969年出生，，碩士，教授，研究方向：中藥新劑型，新技術(shù)，新工藝的研究Tel∶13608170046 Email∶1836820767@qq.com

2017-04-24

(責(zé)任編輯：傅舒)