黃秉一，徐朝軍，宋 嵐

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸心外科，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

原花青素促進(jìn)三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究

黃秉一1，徐朝軍2，宋 嵐3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸心外科，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的研究原花青素（Procyanidins,PC）對(duì)三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株增殖及細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。方法常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，24 h后隨機(jī)分為陽(yáng)性對(duì)照組、對(duì)照組和PC10、20、40、80、160、320 μg/mL組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western blot法檢測(cè)FoxA1蛋白及抗凋亡蛋白bcl2、UCP2表達(dá)。結(jié)果PC各劑量組均可顯著抑制抑制 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖（P＜0.05）；PC（10-160 μg/mL）組劑量依賴性抑制 MDA-MB-231 細(xì)胞增殖（P＜0.05），PC（40-320 μg/mL）可以時(shí)間依賴性抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05）；PC320 μg/mL 組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞抑制率與 PC160 μg/mL 組差異無(wú)顯著性（P＞0.05）； 160 μg/mL PC 可以時(shí)間依賴性促進(jìn) MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡（P＜0.05）；160 μg/mL PC 作用 24 h 后，F(xiàn)oxA1 蛋白表達(dá)顯著上升（P＜0.05），同時(shí) bcl2 及 UCP2 表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)C 抑制 MDA-MB-231 細(xì)胞，促進(jìn) MDA-MB-231 細(xì)胞凋亡，升高其FoxA1表達(dá)，同時(shí)降低bcl2及UCP2表達(dá)，表明PC可能通過(guò)促進(jìn)FoxA1表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的作用。

原花青素；MDA-MB-231細(xì)胞；三陰乳腺癌；FoxA1細(xì)胞凋亡

原花青素（procyandin,PC）是自然界來(lái)源豐富的多酚類黃酮植物化合物，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成。目前在葡萄籽、荔枝殼等多種植物中含量豐富。研究發(fā)現(xiàn)，原花青素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、心血管保護(hù)等多種功能[1-5]。在抗腫瘤方面，近年研究顯示，PC可以抑制包括前列腺癌、肺癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞增殖，尤其對(duì)化療藥物耐受的一些腫瘤細(xì)胞株也有較好的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)[5-7]。

FoxA1是翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在胚胎形成、細(xì)胞分化等方面具有重要的功能。研究顯示FoxA1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用，在不同種類的乳腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)oxA1表達(dá)程度不一，對(duì)導(dǎo)致不同種類乳腺癌細(xì)胞對(duì)雌激素敏感性以及對(duì)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)的激素治療的效果及預(yù)后不同[8-10]。本實(shí)驗(yàn)組前期研究顯示原花青素可以調(diào)節(jié)包括乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株在內(nèi)的多種細(xì)胞FoxA1表達(dá)。本研究旨在本課題組前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上觀察PC對(duì)雌激素不敏感型三陰乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并初步探討其是否通過(guò)FoxA1發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購(gòu)自ATCC；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物材料公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；順鉑(DDP)購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；胰蛋白酶和MTT試劑購(gòu)自Sigma公司；兔抗人FoxA1抗體購(gòu)自Abcam公司；鼠抗人B淋巴細(xì)胞瘤-2（bcl2）和解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）抗體購(gòu)自Abcam公司；GAPDH及相應(yīng)二抗抗體、BCA試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

常規(guī)培養(yǎng)人三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（順鉑組）和 PC 組（10、20、40、80、160、320 μg/mL）。

1.3 MTT法檢測(cè)PC對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞常規(guī)消化洗滌后，以1×105/孔接種于96孔培養(yǎng)板，置于5%CO2、37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組分別加入生理鹽水、順鉑、不同濃度PC。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞，按照常規(guī)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，加入MTT后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔570 nm吸光度值（A570）。計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=[（1-實(shí)驗(yàn)組 A570）/對(duì)照組 A570]×100%。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按密度1×106/瓶接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于二氧化碳培養(yǎng)箱24 h后加入PC，使其終濃度分別為160 μg/mL。并按前述實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（順鉑組）和對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，pH7.4 PBS漂洗細(xì)胞，70%酒精固定，-20℃孵育 2 h以上，250 g離心5 min收集細(xì)胞。細(xì)胞重懸于1 mL PBS中，室溫放置10 min，250g離心5 min后細(xì)胞重懸于500 μL PBS （含 0.2%RNase A），37 ℃孵育 30 min。 4 ℃20 g/L碘化丙啶染色30 min，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western-blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按密度1×106/瓶接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于二氧化碳培養(yǎng)箱24 h后加入PC，使其終濃度分別為160 μg/mL。于預(yù)設(shè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，離心后收集上清，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白質(zhì)與上樣緩沖液混勻后煮沸 10 min。20 μg/孔上樣，12%SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，室溫孵育4 h后洗滌3次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育30 min后DAB顯色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PC對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PC不同實(shí)驗(yàn)濃度組與對(duì)照組比較，MDA-MB-231細(xì)胞抑制率明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PC10、20、40、80、160 μg/mL 組同一時(shí)間點(diǎn)不同劑量的PC作用于細(xì)胞后，隨PC濃度增高，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與前一較低濃度比較亦明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PC40、80、160、320 μg/mL組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用隨著時(shí)間增長(zhǎng)而升高，具有時(shí)間依賴性（P＜0.05）；但是 320 μg/mL的PC作用于細(xì)胞后細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞抑制率與160 μg/mL 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 故后續(xù)實(shí)驗(yàn)PC濃度采用160 μg/mL展開。見表1。

表1 PC對(duì)MDA-MB231細(xì)胞增殖的影響 （n=3，±s）

表1 PC對(duì)MDA-MB231細(xì)胞增殖的影響 （n=3，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；同一時(shí)間點(diǎn)PC組與前一低濃度比較，#P＜0.05；同一 PC 組與前一時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.05。

組別細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）24 h 48 h 72 h對(duì)照組PC 10 μg/mL 組PC 20 μg/mL 組PC 40 μg/mL 組PC 80 μg/mL 組PC 160 μg/mL 組PC 320 μg/mL 組順鉑組1.5±0.09 23.6±1.24*30.4±1.72*#35.3±1.66*#40.1±2.31*#44.6±1.87*#45.1±1.53*51.2±1.33*2.1±0.02 25.3±1.17*32.1±1.41*#39.6±1.38*#△45.2±2.65*#△50.1±2.50*#△51.4±1.82*△52.9±2.41*2.4±+0.02 26.8±1.45*35.2±1.27*#45.3±2.15*#△50.5±1.91*#△54.2±3.16*#△55.0±1.27*△54.8±1.73*

2.2 160 μg/mL PC對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

采用 160 μg/mL的 PC與 MDA-MB-231細(xì)胞孵育24 h、48 h和72 h后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較PC160 μg/mL組和順鉑組細(xì)胞凋亡率顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨PC作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率亦上升，具有時(shí)間依賴性（P＜0.05）。 見表 2。

表2 160 μg/mL PC對(duì)MDA-MB231細(xì)胞凋亡的影響（%，n=3，±s）

表2 160 μg/mL PC對(duì)MDA-MB231細(xì)胞凋亡的影響（%，n=3，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與同組前一時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

組別對(duì)照組PC160 μg/mL 組順鉑組24 h 1.46±0.04 20.32±2.51*25.17±1.39*48 h 1.85±0.03 38.01±2.01*#38.95±1.26*#72 h 2.69±0.05 60.57±2.18*#65.16±1.94*#

2.3 160 μg/mL PC 對(duì) MDA-MB-231 細(xì)胞 FoxA1、bcl2和ucp2表達(dá)的影響

采用western-blot檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞FoxA1、bcl2和ucp2蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示：與0 h比較，160 μg/mL的PC作用于MDA-MB-231細(xì)胞后24、48、72 h，F(xiàn)oxA1 表達(dá)均顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且隨PC作用時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)oxA1表達(dá)上升具有時(shí)間依賴性 （每一時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.05）；而 bcl2和 UCP2表達(dá)則明顯下降，也具有時(shí)間依賴性，差異有顯著性 （與0 h比較P＜0.05，每一時(shí)間點(diǎn)與前一時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.05）。見圖1和表3。

圖 1 western-blot檢測(cè) 160 μg/mL PC對(duì) MDA-MB231細(xì)胞FoxA1、bcl2及UCP2蛋白表達(dá)的影響

表 3 160 μg/mL PC 對(duì) MDA-MB231細(xì)胞 FoxA1、bcl2及UCP2 蛋白表達(dá)的影響（相對(duì)灰度值，n=3，±s）

表 3 160 μg/mL PC 對(duì) MDA-MB231細(xì)胞 FoxA1、bcl2及UCP2 蛋白表達(dá)的影響（相對(duì)灰度值，n=3，±s）

注：與 0 h 比較，*P＜0.05；與前一時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05。

FoxA1 bcl2 UCP2 0 h 1.0±0.05 1.0±0.03 1.0±0.05 24 h 1.34±0.021*0.85±0.017*0.75±0.092*48 h 1.87±0.025*#0.56±0.008*#0.62±0.073*#72 h 2.31±0.232*#0.38±0.033*#0.58±0.054*#

3 討論

三陰乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是一種特殊的乳腺癌亞型，TNBC系雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體 (progesterone receptor，PR)和人類表皮生長(zhǎng)因子受體一2(human epidermal growth factor receptor.2，Her.2) 表達(dá)均陰性的乳腺癌，侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。我國(guó)TNBC發(fā)病率約占乳腺癌的1／4[11]。TNBC患者的5年無(wú)病生存率 (disease free survival，DFS)和總生存率 (overall survival，OS)均顯著低于非TNBC患者[12]。TNBC易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移、生存率低，在臨床治療中有一定的難度。由于缺乏有效的內(nèi)分泌治療及靶向治療，目前以蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的化療為主，但療效欠佳，容易早期局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此尋找有效的藥物治療是目前亟待解決的問(wèn)題。

研究顯示，原花青素可以通過(guò)抗氧化和清除自由基、抗炎、調(diào)節(jié)NF-κB及其目標(biāo)基因、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和抑制血管生成等機(jī)制起到抗癌作用。而且體內(nèi)和體外腫瘤模型實(shí)驗(yàn)均證明原花青素對(duì)各種腫瘤均有抑制作用[5-7]。有研究顯示，原花青素可以通過(guò)caspase途徑促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡[13]。但是目前尚未見其對(duì)TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)用原花青素能顯著抑制MDA-MB231細(xì)胞增殖，并促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。為探討研究原花青素誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的機(jī)制，課題組檢測(cè)了FoxA1蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示原花青素作用24小時(shí)后FoxA1蛋白表達(dá)顯著上升，而抗凋亡基因bcl2及UCP2表達(dá)降低。以前的研究顯示FoxA1在多種腫瘤細(xì)胞中可以抑制bcl2和UCP2基因的表達(dá)[14-15]。因此推測(cè)，在MDA-MB-231細(xì)胞中原花青素可能通過(guò)升高FoxA1表達(dá)并進(jìn)一步抑制bcl2和UCP2表達(dá)，從而抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。詳細(xì)作用機(jī)制還需要離體及在體進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 匡靜之）

Effect of Procyanidin in Promoting Apoptosis of MDA-MB-231 Triple-Negative Breast Cancer Cell Lines

HUANG Bingyi1,XU Zhaojun2,SONG Lan3*
（1.General Surgery,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China；2.Department of Cardiothoracic Surgery,the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China;3.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China）

ObjectiveTo study the effect and mechanism of procyanidins(PC)on the proliferation and apoptosis of MDAMB-231 breast cancer cell line.MethodsThe cells were randomly divided into positive control group,control group and PC(10,20,4.,80,160,320 μg/mL)groups.Growth inhibiting rate of MDA-MB-231 cell was detected by MTT assay.Apoptosis was detected by flow cytometry,and the expression of FoxA1 protein and anti apoptotic protein (UCP2 and bcl2)were detected by Western blot.ResultsDifferent doses of PC could infinicantly inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells(P＜0.05).The inhibition rate of cell growth in the range of 10-160 μg/mL was dose-dependent(P＜0.05),and the inhibition rate of cell growth in the range of 40-320 μg/mL was time-dependent （P＜0.05).However,there was no significant between 160 μg/mL group and 320 μg/mL group in the inhibition rate of cell growth (P＞0.05).160 μg/mL PC could promote the apoptosis of MDA-MB-231 cells in the time-dependent(P＜0.05).The expression of FoxA1 protein significantly increased after 160 g/mL PC for 24 h (P＜0.05),while the expression of UCP2 and bcl2 decreased (P＜0.05).ConclusionPC could promote the apoptosis of MDA-MB-231 cells and decrease the expression of bc12 and UCP2,which may through promoting the expression of FoxA1.

procyandin;MDA-MB-231 cell;breast cancer;FoxA1;apoptosis

R286

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.007

本文引用：黃秉一，徐朝軍，宋 嵐.原花青素促進(jìn)三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（11）：1196-1199.

2016-12-11

湖南省教育廳課題（13C691）。

黃秉一，男，副主任醫(yī)師，主要從事乳腺及腹部外科疾病研究。

* 宋 嵐，女，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：344069980@qq.com。