宛玉祥，陳 林,2，唐雪陽，沈冰冰，黃惠勇，張水寒,2,4*

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013；2.湖南省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務(wù)中心，湖南 長沙 410013；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；4.湖南省2011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208）

雪峰蟲草乙酸乙酯及石油醚部位的GC-MS分析

宛玉祥1，陳 林1,2，唐雪陽1，沈冰冰1，黃惠勇3，張水寒1,2,4*

（1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙 410013；2.湖南省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務(wù)中心，湖南 長沙 410013；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；4.湖南省2011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208）

目的利用GC-MS分析技術(shù)鑒定雪峰蟲草中的揮發(fā)性成分。方法采用Rxi-5MS（30 m×0.25 mm,0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱；以高純He氣（純度99.999%）為載氣，進(jìn)行程序升溫；質(zhì)譜定性以EI電離方式采集數(shù)據(jù)；根據(jù)NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫推測雪峰蟲草的物質(zhì)成分。結(jié)果分別從雪峰蟲草的石油醚部位中鑒定了44個化合物；從雪峰蟲草的乙酸乙酯部位中鑒定了28個化合物。兩部位的主要化合物類型為酸類、酯類以及甾醇類，石油醚和乙酸乙酯部位的相對含量分別占78.5%和77.36%。結(jié)論首次采用GC-MS方法對雪峰蟲草兩部位的揮發(fā)性成分進(jìn)行對比分析，以期為雪峰蟲草的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

GC-MS；雪峰蟲草；甾醇類化合物

雪峰蟲草是線蟲草菌科真菌雪峰蟲草菌(Ophiocordyceps xuefengensis)寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體，同時也是新的蟲草類藥用資源，經(jīng)鑒定是目前同屬真菌中與冬蟲夏草親緣關(guān)系最近的一個種[1]。前期本團(tuán)隊對雪峰蟲草不同萃取部位的體外抗腫瘤實驗研究發(fā)現(xiàn)雪峰蟲草石油醚部位和乙酸乙酯部位均對NB4細(xì)胞有抑制作用。本研究以雪峰蟲草石油醚部位和乙酸乙酯部位為研究對象，通過GC-MS檢測手段對雪峰蟲草有效部位的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。旨在研究雪峰蟲草抗腫瘤部位化學(xué)成分，并為雪峰蟲草后續(xù)物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

2010 plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 （日本島津集團(tuán)）；LGJ-10型凍干機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；Rxi-5MS（30 m×0.25 mm,0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱（日本島津集團(tuán)）；NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。

1.2 材料

雪峰蟲草 Ophiocordyceps xuefengensis sp.nov.，采自湖南省洞口縣，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院朱如彩研究員與劉浩助理研究員共同鑒定為正品；娃哈哈純凈水 (湖南長沙娃哈哈飲料有限公司)；石油醚（60～90℃，分析純，天津中和盛泰化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取雪峰蟲草粉末（過三號篩）150 g，精密稱定，置2 000 mL圓底燒瓶，加入8倍量蒸餾水回流提取兩次，首次 2.5 h，第二次 1.5 h，過濾，棄去濾液；殘渣加6倍量75%乙醇回流提取兩次，首次2.5 h，第二次1.5 h，濾過，收集濾液，減壓濃縮至200 mL。濃縮濾液用等體積石油醚連續(xù)多次萃取，至石油醚層近無色，合并萃取液，減壓濃縮至約50 mL，轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)皿中，至冷凍干燥機中干燥24 h，即得雪峰蟲草石油醚粗提凍干粉。經(jīng)石油醚萃取過的濃縮濾液用等體積乙酸乙酯連續(xù)多次萃取，至乙酸乙酯層近無色，合并萃取液，減壓濃縮至約50 mL，轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)皿中，至冷凍干燥機中干燥24 h，即得雪峰蟲草乙酸乙酯粗提凍干粉。

取雪峰蟲草石油醚粗提凍干粉約0.01 g，精密稱定，正己烷定容至10 mL，必要時超聲處理。石油醚供試品溶液以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

取雪峰蟲草乙酸乙酯粗提凍干粉約0.01 g，精密稱定，乙酸乙酯定容至10 mL，必要時超聲處理。乙酸乙酯供試品溶液以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 氣質(zhì)聯(lián)用分析條件

2.2.1 石油醚氣質(zhì)聯(lián)用條件 Rxi-5MS（30 m×0.25 mm,0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，升溫程序：初始溫度160℃，保持 2 min，以4℃/min升溫至170℃，保持5 min；以1℃/min升溫至185℃，保持10 min；以4℃/min升溫至210℃；保持 2 min，以4℃/min升溫至260℃，保持5 min；以1℃/min升溫至280℃；保持2 min；進(jìn)樣口溫度230℃；載氣為高純He 氣（純度 99.999%）；柱流量 1.0 mL/min；進(jìn)樣分流比30∶1。電離方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；接口溫度250℃；四極桿溫度150℃；全掃描采集模式；掃描質(zhì)量范圍m/z10～500。

2.2.2 乙酸乙酯氣質(zhì)聯(lián)用條件 Rxi-5MS （30 m×0.25 mm,0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，升溫程序：初始溫度180℃，保持2 min，以4℃/min升溫至200℃，保持5 min；以3℃/min升溫至210℃，保持 5 min；以3℃/min升溫至260℃；保持 5 min，以3℃/min升溫至280℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度230 ℃；載氣為高純 He氣（純度99.999%）；柱流量1.2 mL/min；進(jìn)樣分流比 30∶1。 電離方式 EI；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；接口溫度250℃；四極桿溫度150℃；全掃描采集模式；掃描質(zhì)量范圍 m/z10～500。

2.3 結(jié)果與分析

2.3.1 石油醚部位分析結(jié)果 對雪峰蟲草石油醚部位進(jìn)行GC-MS分析，見圖1，通過NIST譜庫檢索分析所檢出成分及結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報道[2-3]，并且核對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定了44種化學(xué)成分，并用峰面積歸一化法計算出各成分相對含量。結(jié)果見表1。

圖1 雪峰蟲草石油醚部位總離子流圖

通過對檢測出的44種化合物的類型數(shù)目和相對含量進(jìn)行分析，結(jié)果雪峰蟲草石油醚部位檢測出的44個化合物，占總峰面積的86.15%。其中，各化合物類型的數(shù)目從大到小：酯(13)＞酸(11)＞烴(6)＞甾

醇(5)>酰胺(3)>其它(2)>醛(1)=酮(1)=醇(1)=酚（1）。 相對含量：酸(40.00%)>酯(32.80%)>甾醇(5.70%)>烴(3.42%)>酰胺 (3.28%)>醇 (0.12%)> 酚 (0.50%)>酮(0.04%)。

表1 雪峰蟲草石油醚部位GC-MS結(jié)果

2.3.2 乙酸乙酯部位分析結(jié)果

對雪峰蟲草乙酸乙酯部位進(jìn)行GC-MS分析，見圖2，通過NIST譜庫檢索分析所檢出成分，并且核對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定了28種化學(xué)成分，并用峰面積歸一化法計算出各成分相對含量。結(jié)果見表2。

圖2 雪峰蟲草乙酸乙酯部位總離子流圖

表2 雪峰蟲草乙酸乙酯部位GC-MS結(jié)果

雪峰蟲草乙酸乙酯部位檢測出28個化合物，占總峰面積的84.84%。其中，各化合物類型的數(shù)目從大到?。乎ィ?）>醇（4）>酸（3）=酰胺（3）=其它（3）>酮（2）=烴（2）>甾醇（1）=酚（1）。 相對含量從大到小見圖 6：酸（60.32%）>酯（11.88%）>甾醇（5.16%）>酰胺（2.16%）>其它（1.98%）>醇（1.89%）>酚（0.84%）>酮（0.58%）>烴（0.03%）。

3 討論

本研究應(yīng)用GC-MS技術(shù)分別對雪峰蟲草石油醚和乙酸乙酯部位的化學(xué)成分類型及相對含量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明兩部位的主要化合物類型為酸類、酯類以及甾醇類，相對含量分別占78.50%和77.36%。另外，雪峰蟲草石油醚和乙酸乙酯部位的共有成分有10種，麥角甾醇在乙酸乙酯中的相對含量（5.16%）明顯高于石油醚中的（3.46%）。在石油醚部位發(fā)現(xiàn)了5種甾醇類物質(zhì)，其中4種為麥角甾醇及其衍生物，其中麥角甾醇相對含量為3.46%，另有3種麥角甾醇的衍生物相對含量分別為 （0.32%、1.20%、0.30%）。據(jù)相關(guān)報道，麥角甾醇具有抗腫瘤活性，是維生素D的前體，對4種癌細(xì)胞 (B16黑色素細(xì)胞瘤、MCF-7乳腺癌細(xì)胞瘤系、HL-60非白血性白血病細(xì)胞系、HepG2人類肝癌細(xì)胞)都具有顯著的抑制作用[4-6]。但麥角甾醇的抗腫瘤機制尚未達(dá)成共識，目前研究表明，麥角甾醇對肝癌細(xì)胞HepG2增殖有明顯的抑制作用，其機制可能與增高p21mRNA和蛋白表達(dá)或者通過抑制血管生長有關(guān)[7-8]。酸類化合物共有11種，相對含量40.00%，其中，不飽和酸有5種，分別為9-十六碳烯酸、14-十五碳烯酸、反油酸、亞油酸、油酸。據(jù)報道，不飽和脂肪酸有明顯的生理活性功能，其中亞油酸相對含量為3.16%，亞油酸為功能性不飽和脂肪酸，具有抗炎以及抑制腫瘤細(xì)胞的作用[9-10]。乙酸乙酯部位相對含量最高的化合物為油酸（31.99%），其次為棕櫚酸（26.55%），再次為麥角甾醇（5.16%）。研究表明棕櫚酸及亞油酸能使骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡，可能為抑制氧化應(yīng)激引起的過氧化損傷[11]。

本研究應(yīng)用GC-MS技術(shù)分別對雪峰蟲草有效部位石油醚和乙酸乙酯部位兩部位的揮發(fā)性成分類型及相對含量進(jìn)行測定對比并進(jìn)行了鑒定，其中石油醚部位鑒定出44個化合物，乙酸乙酯部位鑒定出28個化合物，本研究首次采用GC-MS技術(shù)對雪峰蟲草石油醚和乙酸乙酯部位的揮發(fā)性成分化學(xué)進(jìn)行了分析，為雪峰蟲草抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)研究與后續(xù)開發(fā)提供參考和借鑒。

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（本文編輯 蘇 維）

GC-MS Analysis of Ethyl Acetate and Petroleum Ether Extract from Ophiocordyceps xuefengensis

WAN Yuxiang1,CHEN Lin1,2,TANG Xueyang1,SHEN Bingbing1,HUANG Huiyong3,ZHANG Shuihan1,2,4*
(1.Hunan Academy of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410013,China；2.Hunan Chinese Medicine Raw Material Quality Monitoring Technology Service Center,Changsha,Hunan 410013,China；3.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;4.2011 Collaboration and Innovation Center for Digital Chinese Medicine in Hunan,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo identify the volatile constituents from Ophiocordyceps xuefengensis by GC-MS.MethodsThe separation was performed on a Rxi-5MS (30 m×0.25 mm,0.25 μm)with high purity He gas (purity 99.999%)by temperature programmed chromatograph.Electron Ionization EI source was applied.The structure of material composition was speculated by the Mass spectrometry database(NIST).Results44 compounds were elucidated from the petroleum ether portion of Ophiocordyceps xuefengensis,28 compounds were elucidated from the ethyl acetate portion of Ophiocordyceps xuefengensis.The main compounds of the two parts were acids,esters,sterols,of which relative content were 78.5%and 77.36%,respectively.ConclusionThe volatile constituents of two parts from Ophiocordyceps xuefengensis firstly by GC-MS were compared.It may provide scientific evidence for pharmacodynamic material basis in this plants.

GC-MS;Ophiocordyceps xuefengensis;sterol compounds

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.010

本文引用：宛玉祥，陳 林，唐雪陽，沈冰冰，黃惠勇，張水寒.雪峰蟲草乙酸乙酯及石油醚部位的GC-MS分析[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（11）：1209-1213.

2017-05-17

國家自然科學(xué)基金面上項目（81673585）；湖南省科技重大專項 (2014FJ1007)；湖南省自然科學(xué)基金（2016JJ4055）。

宛玉祥，男，碩士，研究方向：中藥制劑中藥分析。

*張水寒，女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:zhangshuihan0220@126.com。