費中杰 揚州大學獸醫(yī)學院 225001

一例羊源肺炎克雷伯菌和大腸桿菌混合感染的診斷

費中杰 揚州大學獸醫(yī)學院 225001

2016年11月，泰州市某畜主送2只病羊到揚州某動物醫(yī)院就診。病羊主要表現(xiàn)為精神沉郁、眼睛紅腫、咳嗽。從病羊中分離出一株肺炎克雷伯菌和一株大腸桿菌。藥敏試驗結(jié)果表明，兩種菌株對諾氟沙星和氧氟沙星等藥物高敏，對青霉素和紅霉素等藥物耐藥。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果及時調(diào)整用藥方案，從而使病情迅速得到控制。

羊；肺炎克雷伯菌；大腸桿菌

肺炎克雷伯菌廣泛分布于動物的呼吸道和消化道中，是一種條件致病菌。該菌在韓國、歐洲和非洲等地都有報道，并呈現(xiàn)增多的趨勢[1]。近年來由于抗生素的濫用，導致肺炎克雷伯菌的耐藥性普遍存在，給治療帶來困難[2]。本研究從病死湖羊的組織中分離培養(yǎng)出一株肺炎克雷伯菌和一株大腸桿菌，通過實驗室診斷和藥敏試驗，為病羊的診斷與治療提供依據(jù)。

1 材料

（1）病料來源。泰州某養(yǎng)殖場2只湖羊。

（2）主要試劑。血平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸桿菌科細菌生化鑒定管 （杭州微生物）、16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（寶生物工程有限公司）和大腸桿菌診斷血清（杭州微生物）等。

2 方法

（1）剖檢病變。剖檢可見肺淤血、壞死，心外膜增厚，肝臟腫大、壞死，腸道出血，其他組織器官無特征病變。

（2）細菌分離培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取病變臟器內(nèi)部組織，在麥康凱平板劃線，放入37°C恒溫箱中培養(yǎng)18小時，觀察結(jié)果。

（3）革蘭氏染色鑒定。挑取疑似菌落進行固定，滴加結(jié)晶紫初染1分鐘、碘液1分鐘、乙醇脫色0.5分鐘、沙黃水溶液復染30秒，吸干，鏡檢[3]。

（4）生化試驗。菌株1和菌株2均屬于腸桿菌科，用腸桿菌科細菌生化鑒定管鑒定。

（5）血清型鑒定。將菌株1和菌株2用大腸桿菌診斷血清做玻板凝集試驗進行鑒定。

（6）16S rRNA基因序列測定。將純化好的菌液煮沸法提取DNA作為PCR模板，用16SrDNA Bacterial PCR Kit試劑盒中的通用引物進行擴增。將擴增產(chǎn)物送去金斯瑞公司進行測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析。

（7）藥敏試驗。取純化好的菌液滅菌棉簽在LB培養(yǎng)基上涂抹均勻，再用滅菌鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上。然后將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中，經(jīng)18～24小時用尺測量抑菌圈直徑。

3 結(jié)果

（1）細菌形態(tài)。分別挑取單菌落進行純化培養(yǎng)，分離到2種菌株。菌株1在麥康凱培養(yǎng)基上形成圓形隆起、光滑、濕潤、邊緣整齊、偏大的紅色菌落，在血培養(yǎng)基上形成圓形隆起、光滑、濕潤、較大的灰白色菌落。菌株2與菌株1相似，顏色偏淡，形態(tài)較小。

（2）革蘭氏染色結(jié)果。菌株1在光學顯微鏡下可以觀察到粉紅色的直桿菌，菌體較大，兩端鈍圓，散在或成對。菌株2與1相似，形態(tài)較小。

（3）生化試驗結(jié)果。菌株1對照伯杰氏細菌手冊，鑒定結(jié)果該菌株為大腸桿菌。菌株2鑒定結(jié)果該菌株為肺炎克雷伯菌（見表1）。生化特性與楊紅軍等研究一致[4]。

表1 生化試驗結(jié)果

（4）血清型鑒定結(jié)果。將菌株1和菌株2分別進行血清型鑒定，通過大腸桿菌診斷血清，玻板凝集試驗確定菌株1是大腸桿菌，血清型是020。

（5）16S rDNA序列測定。菌株2PCR擴增的產(chǎn)物條帶為1800bp（見圖1）。序列與肺炎克雷伯菌的序列同源性達到99%以上（見圖1）。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 序列比對圖

（6）藥敏試驗結(jié)果。菌珠1和2分別選用24種藥物做藥敏試驗。結(jié)果表明大腸桿菌對頭孢唑啉等13種藥物高敏，對頭孢氨芐等4種藥物中敏，對苯唑西林等7種藥物耐藥；肺炎克雷伯菌對頭孢唑啉等8種藥物高敏，頭孢氨芐等4種藥物中敏，對紅霉素等12種藥物耐藥（見表2）。

表2 藥敏試驗結(jié)果（單位：mm）

4 小結(jié)與討論

（1）肺炎克雷伯菌是羊腸道中的一種常在菌，在飼養(yǎng)管理不善的養(yǎng)殖場，肺炎克雷伯菌病經(jīng)常發(fā)生，從而給養(yǎng)殖場造成嚴重的經(jīng)濟損失。

（2）在觀察疑似菌落時注意大腸桿菌，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的顏色、形態(tài)相似，而且少數(shù)大腸桿菌對羊具有致病性。通過血清型鑒定，分離出大腸桿菌的血清型是020，結(jié)合相關(guān)文獻研究，確定血清型020對羊沒有致病性[5]，從而確認肺炎克雷伯菌是致病菌，需要開展動物試驗進一步確認。

（3）藥敏實驗結(jié)果顯示，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌均對喹諾酮類藥物高敏，用諾氟沙星對羊群進行預防治療，使疫情得到了控制。在臨床用藥過程中，我們應當選擇敏感性高的藥物治療。

[1]Shon AS，Bajwa RP，Russo TA， Hypervirulent（hypermucoiscous）Klebsiella pneumoniae：a new and dangerous breed.[J]Virulence.2013，4（2）：107-118.肺炎克雷伯菌的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2012，48（2）:1-2.

[2]張智，李再新，曾光菊，李丙超，胡衛(wèi)東，趙志平，劉章琴，陳欲云.一株兔源耐藥性肺炎克雷伯菌的分離與鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（9）:1-5.

[3]李超，王玉英，王冬冬，范丹丹，王平，紀鴻翔，尹燕博.引起幼貂大量死亡的肺炎克雷伯菌的分離和鑒定 [J].中國獸醫(yī)雜志，2015，11（51）:1-4.

[4]楊紅軍，陳海華，孫鳳青，王豪舉，彭遠義，張建明.雞肺炎克雷伯菌的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志.2009，7（45）:1-2.

[5]黃青云.畜牧微生物學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009，5:220-221.