李亞萍，彭 燕

(四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川 成都 611130)

IAA改善PEG處理下白三葉幼苗葉片抗氧化保護和滲透調(diào)節(jié)能力

李亞萍，彭 燕

(四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川 成都 611130)

以‘Pixie’白三葉(Trifoliumrepenscv. ‘Pixie’)為試材，通過PEG(聚乙二醇-6000)模擬干旱脅迫，研究植物生長素(IAA)對白三葉幼苗抗旱性的影響。結(jié)果表明，1 μmol·L-1IAA能夠顯著(Plt;0.05)提高15% PEG(-0.3 MPa)干旱脅迫下白三葉幼苗的抗旱性；外源IAA不同程度地提高了白三葉幼苗葉片超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶活性，以及還原型ASA和GSH的含量，降低相對電導率、丙二醛、超氧陰離子和過氧化氫含量，有效緩解了葉片膜質(zhì)損傷和氧脅迫傷害；外源IAA亦可顯著提高白三葉葉片總氨基酸和游離脯氨酸含量，有效降低了滲透勢，提高葉片相對含水量。相似地，干旱條件下外源1 μmol·L-1IAA提高了離體葉片相對含水量并有效緩解了膜質(zhì)損傷，但60 μmol·L-1極性運輸抑制劑(NPA)以及60 μmol·L-1合成抑制劑(L-AOPP)不同程度地加劇了葉片失水和膜質(zhì)損傷。以上結(jié)果表明：1 μmol·L-1IAA通過提高干旱脅迫下白三葉抗氧化保護能力和滲透調(diào)節(jié)能力，改善了白三葉幼苗的抗旱性。

白三葉；干旱脅迫；生長素；膜質(zhì)損傷；抗氧化保護;滲透調(diào)節(jié)

植物激素在響應(yīng)外界刺激和內(nèi)部信號中扮演著關(guān)鍵角色，植物激素IAA及其分配比率調(diào)控了植物的生長模式和發(fā)展過程，包括頂端優(yōu)勢、向光性、向重力性以及胚胎的形成發(fā)展、器官的形態(tài)發(fā)生、維管組織的分化和向性生長等[1-2]。研究表明，IAA與植物逆境脅迫反應(yīng)關(guān)系密切，且通過調(diào)控生長素響應(yīng)基因的表達，改善植物對環(huán)境脅迫的忍耐性。目前的研究主要發(fā)現(xiàn)了3個家族的早期IAA信號響應(yīng)基因，分別為Aux/IAA(Auxin/indoleacetic)、GH3(Gretchen Hagen 3)以及SAUR(Small auxin up RNA)[3-4]。研究證明，水稻(Oryzasativa)中鑒定出的31個Aux/IAA基因，其中有些基因受干旱、鹽以及冷脅迫的誘導[5-6]；Feng等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鹽、干旱以及重金屬(Cd)脅迫等調(diào)控了13個玉米(Zeamays)zmGH3基因的表達水平。外源添加NAA提高了ABA、IAA含量以及抗氧化酶的活性，增強了大豆(Glycinemax)的抗旱性[8]。外源IAA處理誘導ROS的瞬時增加[9-10]，并增加了玉米細胞過氧化氫酶的活性[11]；提高擬南芥(Arabidopsisthaliana)幼苗抗氧化酶的活性，增加了抗旱性[12]；轉(zhuǎn)入生長素合成基因iaaH和超表達OSIAA6基因促進生長素合成，增強植株的抗旱性[13-14]，因此，IAA可能通過含量的變化調(diào)控植物對干旱的響應(yīng)。

目前，IAA與植物逆境脅迫的關(guān)系已成為研究的重點，但大多研究主要集中在擬南芥、玉米、水稻等模式植物。白三葉(Trifoliumrepens)是一種優(yōu)良的豆科牧草，同時也是一種常見的園林地被植物，因其調(diào)控蒸騰能力低，根系不發(fā)達等原因，易遭受干旱脅迫。因此，本研究以白三葉品種‘Pixie’為材料，通過根施IAA和采用IAA極性運輸抑制劑(NPA)[15]、生物合成抑制劑(L-AOPP)[15]處理離體葉片，來探索PEG干旱脅迫下，IAA對白三葉品種‘Pixie’抗旱性的影響，旨在為研究IAA與植物抗逆性影響提供理論依據(jù)，也為改善白三葉抗旱性尋找新方法。

1 材料與方法

1.1供試材料

供試種子白三葉‘Pixie’購自北京猛犸種業(yè)有限公司，IAA購自Sigma公司。

1.2試驗設(shè)計

1.2.1材料培養(yǎng) 稱取籽粒飽滿、大小均一的白三葉種子0.8 g，先經(jīng)5%的NaClO消毒洗凈后，均勻撒播于裝有等量石英砂的培育盆中(深9 cm，寬18 cm，長24 cm)，培育盆置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，條件為白天23 ℃/16 h，夜間19 ℃/8 h，光照強度為500 mmol·(m2·s)-1，相對濕度為75%，前7 d每天補充蒸餾水，待種子發(fā)芽后用Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗，每2 d更換一次營養(yǎng)液，每天按一定次序輪換材料的位置，至植株長出兩片成熟葉片(約30 d)時，用于試驗處理。

1.2.2外源IAA處理與干旱脅迫 將上述培育的材料進行如下3個處理:1)對照(CK)，以Hoagland全營養(yǎng)液正常培養(yǎng)材料；2)PEG處理 (D)，使用含有15% PEG-6000的Hoagland全營養(yǎng)液進行干旱脅迫處理；3)IAA預處理后再進行PEG處理(IAA+D)，Hoagland全營養(yǎng)液中加入1 μmol·L-1的IAA預處理7 d后，再用15% PEG-6000，滲透勢為-0.3 MPa進行干旱脅迫處理，每個處理設(shè)4個生物學重復。分別于PEG處理0、7、14 d時取樣測定各處理白三葉葉片的相關(guān)生理指標。

1.2.3離體葉片的IAA及其合成與極性運輸抑制劑處理 材料培養(yǎng)同1.2.1，剪取白三葉幼苗的第2片成熟葉在蒸餾水中浸泡1 h，以消除機械損傷。然后放入50 mL離心管中分別進行以下處理：1)CK(對照)，用蒸餾水浸泡葉片；2)D，用15%的PEG溶液浸泡葉片；3)D+IAA，用含有1 μmol·L-1IAA的15%PEG溶液浸泡葉片；4)D+NPA，用含有60 μmol·L-1Naptalam(NPA，IAA極性運輸抑制劑)的15%PEG溶液浸泡葉片；5)D+L-AOPP用含有60 μmol·L-1L-2Aminooxy-3-pheny propionic acid (L-AOPP， IAA合成抑制劑)的15%PEG溶液浸泡葉片，處理時間為12 h，每個處理設(shè)6個生物學重復，每個重復有16片葉。

1.3指標測定及方法

相對含水量(relative water content，RWC)采用烘干法測定[16]；電解質(zhì)滲透率(relative electrolytic leakage，EL)采用電導率儀測定[17]；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[18];超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用核黃素-NBT法測定[19];過氧化氫酶(catalase，CAT)采用紫外吸收法進行測定[20]； 過氧化物酶(peroxidase，POD)采用愈創(chuàng)木酚顯色法法測定[20];抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性參照Nakano 和Asada[21]的方法測定；超氧陰離子(oxygen free radical，O2-)含量和過氧化氫(H2O2)含量用酶標儀法測定，試劑盒由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供；還原型抗壞血酸含量(ascorbic acid，ASA)和還原型谷胱甘肽含量(reduced glutathione，GSH)以及氨基酸(amino acid，AA)采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒測定；游離脯氨酸含量采用茚三酮比色法[18]；可溶性糖含量采用蒽酮乙酸乙酯比色法測定[18]；葉片滲透勢采用露點滲透壓儀(Vapro Pressure Osmometer，Wescor，Inc.，Logan，UT 84321，USA)測定。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003進行繪圖與數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 19.0軟件對全文數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析和顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1IAA對干旱脅迫下白三葉幼苗外觀表現(xiàn)的影響

正常水分條件下(0 d)，各處理白三葉長勢良好，葉片外觀表現(xiàn)沒有差異(圖1)。PEG處理7 d時，經(jīng)IAA預處理的白三葉植株萎蔫程度較輕，而直接進行PEG處理的白三葉植株出現(xiàn)明顯萎蔫，說明外源IAA預處理對白三葉遭遇的干旱脅迫有緩解作用。

圖1 IAA對干旱脅迫下白三葉葉片外觀表現(xiàn)的影響

2.2IAA對干旱脅迫下白三葉幼苗RWC、EL以及MDA含量的影響

白三葉葉片的RWC隨著干旱脅迫時間的延長而不斷下降，而外源 IAA預處理則減緩了干旱脅迫下葉片RWC的降低，在處理7和14 d時，IAA預處理白三葉的RWC比直接干旱脅迫分別顯著高出26.45%和26.01%(Plt;0.05)(圖2)。與此同時，白三葉葉片的EL、MDA含量在干旱脅迫下迅速升高，與直接干旱脅迫相比，在7和14 d時，IAA預處理的EL和MDA含量分別比直接干旱脅迫顯著低26.29%、11.79%(圖2B)和21.60%、15.89%(圖2C)(Plt;0.05)，說明外源添加IAA可減輕干旱脅迫對白三葉葉片細胞的損傷。

圖2 IAA對干旱脅迫下白三葉葉片RWC、EL和MDA含量的影響

注：圖中不同小寫字母表示同一時間不同處理間差異顯著(Plt;0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treatments at the same time at the 0.05 level; similarly for the following figures.

2.3IAA對干旱脅迫下白三葉葉片O2-和H2O2含量的影響

15%PEG干旱脅迫誘導O2-和 H2O2在葉片中不斷積累，但IAA處理在脅迫7和14 d時維持了較低的O2-含量，分別低于直接干旱脅迫條件下18.15%和41.51%(Plt;0.05)(圖3)。在干旱脅迫下，白三葉的 H2O2含量逐漸增高，但IAA處理以后， H2O2含量顯著降低。在干旱脅迫7和14 d時，D處理 H2O2含量分別比IAA+D處理顯著高49.37%和36.22%。

2.4IAA對干旱脅迫下白三葉葉片抗氧化酶活性的影響

干旱脅迫下，白三葉葉片SOD、APX活性隨時間延長而持續(xù)升高，IAA預處理進一步提高了SOD、APX活性，在7和14 d時，IAA預處理葉片SOD活性比直接干旱處理分別高出44.05%和36.90%(Plt;0.05)(圖4)，APX活性分別顯著高出41.55%和22.46(Plt;0.05)。隨著干旱脅迫時間的延長，CAT和POD活性呈先升高后下降的趨勢，但在7、14 d， IAA預處理的CAT和POD活性分別是直接干旱處理的1.41、1.69倍和1.51、1.47倍(Plt;0.05)。

圖3 IAA對干旱脅迫下白三葉葉片超氧陰離子和過氧化氫含量的影響

圖4 IAA對干旱脅迫下白三葉葉片抗氧化酶活性的影響

2.5IAA對干旱脅迫下白三葉葉片抗氧化劑含量影響

白三葉幼苗葉片ASA含量隨干旱脅迫時間的延長而降低。在干旱脅迫7和14 d時，與直接干旱脅迫處理相比，外源IAA預處理的ASA含量分別顯著高出28.92%、53.44%(Plt;0.05)(圖5)；干旱脅迫下，白三葉葉片的GSH含量有所增加，7 d時達到最高，然后略有下降。在處理7和14 d時，IAA+D處理比D處理的GSH含量分別顯著高出68.52%和94.28%。

圖5 IAA對干旱脅迫下白三葉葉片ASA和GSH含量的影響

2.6IAA對干旱脅迫下白三葉葉片氨基酸、游離脯氨酸、可溶性糖含量和滲透勢的影響

干旱脅迫下，白三葉葉片總氨基酸和游離脯氨酸含量顯著增加，而外源IAA預處理進一步提高了其含量。在干旱脅迫7、14 d時，IAA預處理的氨基酸和游離脯氨酸較直接脅迫處理分別顯著高出32.70%、31.58%和20.32%、9.04%(Plt;0.05)(圖6)。干旱脅迫下，D處理和IAA+D處理可溶性糖含量7 d時顯著高于對照，14 d時則顯著低于對照，IAA預處理的可溶性糖含量僅在7 d時高出直接干旱脅迫12.30%，14 d時，干旱脅迫兩處理間差異不顯著(Pgt;0.05)。干旱脅迫下，白三葉葉片的滲透勢逐漸降低，在處理7和14 d時，IAA預處理的滲透勢均顯著低于直接干旱處理，說明IAA預處理具有增強干旱脅迫下白三葉的滲透調(diào)節(jié)能力。

2.7IAA、NPA、L-AOPP對干旱脅迫下離體白三葉葉片相對含水量和電導率的影響

為進一步驗證白三葉葉片的內(nèi)源IAA水平與其抗旱性有關(guān)，分別采用極性運輸抑制劑NPA和生物合成抑制劑L-AOPP以改變和減少IAA在白三葉葉片中的分布及含量并測定葉片的抗旱性。與CK相比，PEG處理顯著降低了白三葉葉片的相對含水量(Plt;0.05)，D+NPA、D+L-AOPP處理的相對含水量則進一步降低，且D+L-AOPP處理顯著低于D處理(Plt;0.05)，IAA+D處理的相對含水量則與CK間差異不顯著(Pgt;0.05)(圖7)；在15%PEG溶液中處理12 h后，D、D+L-AOPP、D+NPA處理的相對含水量均顯著低于CK，較CK分別下降了11.7%、16.59%、12.52%。與此同時，D、IAA+D、D+L-AOPP、D+NPA處理的MDA含量均顯著高于CK(Plt;0.05)，且D+L-AOPP處理最高，顯著高于其余處理(Plt;0.05)(圖7)，這說明白三葉葉片內(nèi)IAA含量降低或運轉(zhuǎn)受阻則會降低其抗旱性。

3 討論與結(jié)論

干旱誘導活性氧(ROS)大量積累，超過植物自身清除能力時，細胞發(fā)生過氧化反應(yīng)，嚴重損傷細胞膜系統(tǒng)[22]。為維持細胞活性氧平衡，植物進化出酶類和非酶類抗氧化防御系統(tǒng)。酶系統(tǒng)包括SOD、CAT、POD、APX等，非酶類包括ASA和GSH等抗氧化劑。IAA提高逆境脅迫下抗氧化酶活性和抗氧化劑含量，從而減輕氧脅迫的報道較多。外源IAA通過提高抗氧化酶SOD、CAT、POD等的活性降低了超氧陰離子和過氧化氫含量，從而增強擬南芥幼苗的抗旱性[12]。鹽脅迫下，外源IAA通過提高黃瓜(Cucumissativus)幼苗還原性ASA和GSH的含量，進而增加抗氧化保護能力[23]。在本研究中，外源添加IAA顯著提高白三葉幼苗抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性和還原性ASA、GSH含量，降低了O2-含量和H2O2含量，從而驗證了IAA在白三葉抗氧化防御系統(tǒng)中的促進作用。這與Cha等[24]在研究轉(zhuǎn)入生長素合成酶基因的植株ROS清除能力增強的結(jié)果相似。相對電導率(EL)和丙二醛(MDA)反映了植物細胞膜的損傷程度，二者含量越低說明受到脅迫的影響越小[25]。在本研究根施和離體試驗均表明，外源IAA處理的白三葉葉片EL和MDA含量低于直接干旱脅迫，而NPA和L-AOPP處理MDA含量高于直接干旱脅迫，這進一步說明IAA在應(yīng)對植物干旱脅迫時發(fā)揮著重要作用。

圖6 IAA處理對干旱脅迫下白三葉葉片總氨基酸、脯氨酸和可溶性糖含量和滲透勢的影響

圖7 D、D+IAA、D+L-AOPP、D+NPA處理對白三葉離體葉片相對含水量和MDA含量的影響

干旱條件下植物通過累積可溶性糖、游離氨基酸、有機酸等可溶性小分子滲透物質(zhì)來調(diào)控細胞滲透勢，防止水分散失并維持水分平衡；其次這些有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠保護細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)揮滲透保護的作用[26]。研究表明，逆境脅迫誘導氨基酸含量增加，主要作用在于增強滲透調(diào)節(jié)能力、調(diào)節(jié)鐵離子的運輸、調(diào)控氣孔開放等[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱誘導氨基酸含量增加，但外源IAA進一步誘導了氨基酸含量的增加，說明氨基酸代謝參與了IAA改善的白三葉抗旱性。脯氨酸在響應(yīng)逆境脅迫中不僅發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)和滲透保護的功能，而且還能作為氮的來源維持碳氮平衡[28]，本研究表明，外源IAA減緩了干旱脅迫對白三葉幼苗的傷害，同時增強了脯氨酸合成，暗示了IAA可能參與逆境脅迫下脯氨酸的代謝調(diào)控。干旱誘導可溶性糖含量的增加不僅提高了植物的吸水和保水能力，而且維持了蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)與功能[29]，本研究顯示，干旱脅迫下可溶性糖前期增加，后期降低，外源IAA提高了輕度水分脅迫下可溶性糖含量的增加，但差異未達到顯著。由此說明，干旱脅迫誘導游離總氨基酸、脯氨酸以及可溶性糖含量的增加調(diào)控了白三葉的滲透調(diào)節(jié)能力，降低滲透勢值，但氨基酸含量的增加可能是外源IAA滲透滲值降低和滲透調(diào)節(jié)能力增強的主要原因，這可能也是IAA處理相對含水量高于直接干旱處理的主要原因。

4 結(jié)論

IAA參與眾多植物生長發(fā)育過程，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的IAA(1 μmol·L-1)能夠有效提高白三葉幼苗對干旱環(huán)境的適應(yīng)能力，主要通過以下兩方面的機制：1)外源添加IAA促進抗氧化酶活性以及ASA、GSH含量的升高，提高了白三葉抗氧化能力，有效降低膜質(zhì)損傷和氧傷害；2)外源添加IAA誘導了游離氨基酸含量的升高，提高葉片保水能力，從而提高了植株的耐旱性。

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(責任編輯 武艷培)

Improvementofoxidationresistanceandosmoticregulationofwhitecloverseedlingsbyexogenousauxinunderpolyethyleneglycolstress

Li Ya-ping, Peng Yan

(College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

This research was conducted to investigate the effect of auxin (IAA) on the drought tolerance of white clover (Trifoliumrepenscv. ‘Pixie’) under drought stress induced by polyethylene glycol-6000(PEG-6000) nutrient solution. The results showed that 1 μmol·L-1IAA significantly improved the drought tolerance of white clover fed with a nutrient solution containing 15% PEG (-0.3 MPa). Exogenous IAA improved the activities of antioxidant enzymes including superoxide dismutase, peroxidase, catalase, and ascorbate peroxidase to varying degrees, increased the contents of ascorbate and glutathione, decreased electrolyte leakage, and decreased the contents of malondialdehyde, superoxide anions, and H2O2. These observations indicated that IAA effectively reduced oxidative damage and lipid modifications. Exogenous IAA also significantly increased the contents of total amino acids and proline, and efficiently decreased the osmotic potential, which was associated with an increased relative water content. Similarly, under drought conditions, the treatment with exogenous IAA (1 μmol·L-1) significantly improved the relative water content and alleviated lipid injury in detached leaves, but treatments with auxin biosynthesis inhibitors (60 μmol·L-1naphthylphthalamic acid and 60 μmol·L-1amino-oxyphenylpropionic acid) decreased the relative water content and lipid injury in detached leaves. In conclusion, the results indicated that IAA can effectively increase the capacities of white clover for antioxidant protection and osmoregulation, thereby leading to an improved drought tolerance.

Trifoliumrepens; drought stress; IAA; membrane damage; antioxidant enzyme; osmotic adjustment

Peng Yan E-mail:pengyanlee@163.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0048

李亞萍，彭燕.IAA改善PEG處理下白三葉幼苗葉片抗氧化保護和滲透調(diào)節(jié)能力.草業(yè)科學,2017,34(11)：2295-2302.

Li Y P,Peng Y.Improvement of oxidation resistance protection and osmotic adjustment ability regulation of white clover seedlings by exogenous IAA under PEG stress.Pratacultural Science，2017,34(11)：2295-2302.

S541+.203.4;Q945.79

A

1001-0629(2017)11-2295-08

2017-01-21接受日期2017-04-21

國家自然科學基金(31372371)

李亞萍(1989-),女，甘肅定西人，在讀碩士生，主要從事牧草和草坪草抗逆生理研究。E-mail：m18349237779@163.com

彭燕(1970-)，女，四川成都人，教授，博士，主要從事草坪草牧草逆境生理研究。E-mail：pengyanlee@163.com