杜靈娟，陳凱利，劉雅莉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西北農(nóng)林科技大學(xué))農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

葡萄風(fēng)信子花青素3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及其表達(dá)分析

杜靈娟1,2，陳凱利1,2，劉雅莉1,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西北農(nóng)林科技大學(xué))農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

花青素3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)是花青素苷合成最后一步的關(guān)鍵酶，可把不穩(wěn)定的花青素催化成花青素苷。本研究利用PCR技術(shù)從藍(lán)色葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’(Muscariarmeniacum)中克隆到一個(gè)3GT基因(Ma3GT)，Ma3GTcDNA全長(zhǎng)1 377 bp，編碼458個(gè)氨基酸，與其他植物的3GT蛋白序列相似性達(dá)55%～64%。進(jìn)化分析表明，Ma3GT與單子葉植物3GT聚為一類，與小蒼蘭(Freesiahybrida)、荷蘭鳶尾(Irishollandica)3GT親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，Ma3GT在‘亞美尼亞’花(S4)中高表達(dá)，在葉片中微量表達(dá)，根和鱗莖中幾乎不表達(dá)，在‘白麗人’及‘粉日出’各個(gè)組織中均不表達(dá)。在‘亞美尼亞’中，Ma3GT的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受花發(fā)育調(diào)控，開花早期(S1)幾乎不表達(dá)，隨著花發(fā)育表達(dá)量逐漸增加，至完全開放的時(shí)期(S4)達(dá)到最高峰。此外，Ma3GT在不同品種的花中轉(zhuǎn)錄表達(dá)不同，在藍(lán)色品種‘亞美尼亞’中高表達(dá)，而在白色品種‘白麗人’和粉色品種‘粉日出’中幾乎不表達(dá)。本研究為進(jìn)一步研究Ma3GT基因在葡萄風(fēng)信子花瓣呈色中的功能及其花色分子育種提供基因資源和依據(jù)。

葡萄風(fēng)信子；花青素苷；Ma3GT；RT-PCR；糖基轉(zhuǎn)移酶；糖基化；花色

花色是觀賞植物最主要的品質(zhì)特征之一?；ㄇ嗨剀帐且活愄烊坏乃苄陨?，可使植物呈現(xiàn)出粉、紅、紫和藍(lán)等各種花色[1]。花青素苷有6種常見的基本苷元：天竺葵素苷元、矢車菊素苷元、飛燕草素苷元、芍藥素苷元、錦葵素苷元和矮牽牛素苷元，是由一系列結(jié)構(gòu)基因編碼酶(CHS、CHI、F3H、F3′H、F3′5′H、DFR、ANS和UFGT)催化而成，最后經(jīng)糖基化、?；图谆刃揎椇筠D(zhuǎn)運(yùn)至液泡等部位儲(chǔ)存[2-4](圖1)。糖基化及隨后的?；诨ㄉ揎椫衅鸬疥P(guān)鍵作用，可通過外部氫鍵綁定糖殘基與周圍水分子以增加疏水性 類黃酮的溶解性和穩(wěn)定性[5]。

諸多糖基轉(zhuǎn)移酶參與花青素苷的糖基化過程。糖基轉(zhuǎn)移酶第一大類在其C末端包含44個(gè)氨基酸保守序列，即植物次生產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶信號(hào)序列(PSPG box)，PSPG催化的糖基化可以提高復(fù)合物的溶解性，使其儲(chǔ)存于液泡中，從而保持宿主植物的代謝平衡[6]。其中，研究最為廣泛的是UDP-葡萄糖：花青素3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)。3GT是參與花青素苷合成最后一步的酶(圖1)，它將UDP-葡萄糖上的葡糖基轉(zhuǎn)移到花青素受體分子的C3羥基上，從而形成對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的花青素苷[6]。早期人們?cè)谟衩?Zeamays)、金魚草(Antirrhinummajos)、大麥(Hordeumvulgare)、白蘇(Perillafrutescens)、葡萄(Vitisvinifera)和草莓(Fragariaananassa)等植物中對(duì)3GT酶生物化學(xué)及分子生物學(xué)特征進(jìn)行了研究[7-12]。近年來，人們?cè)谌埬?Gentianatriflora)、矮牽牛(Petuniahybrida)、荷蘭鳶尾(I.hollandica)、小蒼蘭(F.hybrida)、七彩竹芋(Indosasahispida)和中國(guó)水仙(Narcissustazettavar.chinensis)等觀賞植物中克隆了3GT基因并對(duì)其功能進(jìn)行了研究[6,13-17]。

葡萄風(fēng)信子，多年生草本植物,是一種常見的單子葉球根花卉，花開春季，多藍(lán)及藍(lán)紫色系，因其植株低矮，常用作草地中或花壇、花境鑲邊材料，也可作地被植物，用于巖石園或林下[18]。本研究以葡萄風(fēng)信子為研究材料，在實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，篩選一條3GT基因的序列展開研究。首先PCR技術(shù)克隆3GT cDNA序列全長(zhǎng)，利用在線軟件分析其基因特性；將其氨基酸序列與其他物種的GT序列進(jìn)行同源性比對(duì)及進(jìn)化分析；實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了Ma3GT基因在葡萄風(fēng)信子藍(lán)、白、粉色3個(gè)不同品種中的時(shí)空表達(dá)模式，為后續(xù)研究Ma3GT基因在葡萄風(fēng)信子花色形成中的功能提供基礎(chǔ)，為進(jìn)一步闡明葡萄風(fēng)信子花青素苷代謝路徑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1植物材料

本研究于2016年4月至11月在西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選擇3個(gè)葡萄風(fēng)信子品種[‘亞美尼亞’(M.armeniacum)、‘粉日出(M.armeniacum‘Pink Surprise’)及‘白麗人’(M.aucheri‘White Beauty’)]為材料。根據(jù)開花的時(shí)間，將葡萄風(fēng)信子花分為5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(S1～S5)，具體參照焦淑珍等描述[18]。2016年4月在試驗(yàn)田采集3個(gè)品種不同時(shí)期的花、根、鱗莖和葉，液氮速凍后快速置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1葡萄風(fēng)信子總RNA的提取與MaFLS1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆 分別從3個(gè)葡萄風(fēng)信子品種的根、鱗莖、葉以及不同發(fā)育時(shí)期(S1～S5)的花蕾提取總RNA(Omega公司RNA試劑盒)，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的3GT注釋序列，設(shè)計(jì)特異引物3GT-F和3GT-R(表1)，以藍(lán)色葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’各個(gè)組織cDNA混合樣為模板進(jìn)行全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min；28個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。電泳檢測(cè)后回收預(yù)期大小片段的條帶，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選后，挑選陽性克隆送北京奧科生物科技有限公司測(cè)序[19]。測(cè)序后拼接序列，獲得葡萄風(fēng)信子的3GT基因cDNA全長(zhǎng)序列。

圖1 葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’類黃酮物質(zhì)代謝示意圖

1.2.2葡萄風(fēng)信子Ma3GT基因生物信息學(xué)分析 用NCBI中的ORF Finder在線工具查找葡萄風(fēng)信子Ma3GT基因開放閱讀框；用ExPASyProtParam在線預(yù)測(cè)Ma3GT氨基酸序列的組成成分及理化性質(zhì)；用NCBI Blastp搜索同源序列，用ProtScale在線預(yù)測(cè)Ma3GT蛋白的親水性/疏水性；用TMpred在線分析Ma3GT蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；用SignalP 4.1 Server分析Ma3GT蛋白信號(hào)肽；用SOPMA在線分析Ma3GT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。用DNAMAN完成同源序列比對(duì)；用MEGA6.0軟件完成系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建[20-21]。

表1 葡萄風(fēng)信子3GT基因克隆及表達(dá)分析所用的引物

1.2.3葡萄風(fēng)信子Ma3GT基因的時(shí)空表達(dá)分析 為了研究Ma3GT在不同花色葡萄風(fēng)信子的時(shí)空表達(dá)模式，根據(jù)擴(kuò)增獲得的Ma3GT基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物3GT-qPCR-F和3GT-qPCR-R，選取Actin為內(nèi)參基因[19](引物如表1所列)。以3個(gè)品種葡萄風(fēng)信子根、莖、葉，不同發(fā)育時(shí)期花(S1～S5)cDNA作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。參照熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司)說明書，在BIO-RAD Cycler IQ5熒光定量PCR儀上檢測(cè)Ma3GT基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)體系(20 μL)為：SYBR?Premix Ex TaqⅡ 10 μL，PCR正反向引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA模板1 μL(約100 ng)，ddH2O 7.4 μL，反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)讀取由實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自動(dòng)完成。每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用SigmaPlot 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖形繪制[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1葡萄風(fēng)信子Ma3GT基因全長(zhǎng)cDNA克隆與序列特征分析

為了解糖基化過程中重要的編碼酶基因3GT在葡萄風(fēng)信子花色形成的作用，在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，本研究選擇一條3GT注釋序列展開研究。以此條基因序列設(shè)計(jì)特異引物，以藍(lán)色葡萄風(fēng)信子品種‘亞美尼亞’各組織cDNA混合樣為模板PCR擴(kuò)增基因全長(zhǎng)，獲得一條長(zhǎng)1 377 bp的條帶(圖2)，轉(zhuǎn)化測(cè)序后序列拼接，分析其為完整的開放閱讀框，具有起始密碼子和終止密碼子，編碼458個(gè)氨基酸，是一條完整的基因序列(圖3)。命名此cDNA序列為Ma3GT。

在線工具ProtParam分析表明，Ma3GT理論分子量約為48.3 kD，理論等電點(diǎn)為5.69，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為34.15，屬于穩(wěn)定蛋白。利用ProtScale分析，Ma3GT編碼的蛋白親水性/疏水性的最大值為2.111，最小值為-2.478，且親水性氨基酸殘基比疏水性氨基酸殘基多，推測(cè)為親水性蛋白(圖4A)。TMHMM預(yù)測(cè)Ma3GT蛋白無跨膜區(qū)域(圖4B)。SignalP4.1預(yù)測(cè)顯示Ma3GT蛋白不具備信號(hào)肽位點(diǎn)(圖4C)。SOPMA預(yù)測(cè)Ma3GT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為38.21%的α螺旋、12.45%的β轉(zhuǎn)角、33.19%無規(guī)則卷曲和16.16%延伸鏈(圖4D)。

圖2 Ma3GT cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物

注：M，DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，Ma3GTcDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果。

Note：M, DNA marker; 1, The product ofMa3GTcDNA.

圖3 Ma3GT基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2Ma3GT氨基酸序列同源性比對(duì)與進(jìn)化分析

在NCBI上將葡萄風(fēng)信子Ma3GT氨基酸序列進(jìn)行Blastp比對(duì)，分析表明，Ma3GT與油棕(Elaeisguineensis)、海棗(Phoenixdactylifera)3GT同源性最高，可達(dá)63%～64%；與小蒼蘭、荷蘭鳶尾、中國(guó)水仙、洋蔥(Alliumcepa)、福士郁金香(Tulipafosteriana)、小果野芭蕉(Musaacuminatasubsp.malaccensis)等其他物種的同源性較高，達(dá)55%～61%，而與擬南芥、金魚草和矮牽牛等常見模式植物的同源性不高。

用DNAMAN軟件將葡萄風(fēng)信子Ma3GT與其他物種已發(fā)表的3GT進(jìn)行同源序列比對(duì)(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ma3GT蛋白類似于其他3GT蛋白，C末端包含44個(gè)氨基酸的糖基轉(zhuǎn)移酶的PSPG保守序列(從336個(gè)氨基酸到379個(gè)氨基酸)，該序列參與綁定蛋白到糖核苷酸的UDP糖基過程，且其第22(Trp，W)、23(Asn，N)和44(Gln，Q)位氨基酸殘基為葡糖基轉(zhuǎn)移酶中的保守基序，在酶蛋白糖基供體特異性中起到?jīng)Q定性作用。這表明Ma3GT屬于葡糖基轉(zhuǎn)移酶，推測(cè)它與其他物種的3GT具有相同或相似的功能，待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖4 Ma3GT蛋白的生物信息學(xué)分析

注：,親水性/疏水性分析;,氨基酸跨膜分析;?,信號(hào)肽位點(diǎn)分析;,蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);α為α-螺旋;β為β-轉(zhuǎn)角;E為延伸鏈;R為無規(guī)則卷曲。

Note：, Analysis of hydrophilic and hydrophobic amino acids;, Transmembrane analysis; ?, Signal peptide analysis;, Secondary structures prediction; α, indicates alpha helix; β, indicates beta turn; E, indicates extend strand; R, indicates random coil.

圖5 葡萄風(fēng)信子Ma3GT基因編碼的氨基酸序列與其他物種3GT氨基酸序列的比對(duì)

注：氨基酸序列相同及相似部分分別用黑、灰色陰影表示；下劃線位置為PSPG保守序列。黑星號(hào)為PSPG保守序列的第22、23和44個(gè)氨基酸。Fh3GT(小蒼蘭FreesiahybridHM590645)，Ih3GT(荷蘭鳶尾IrishollandicaAB161175)，Zm3GT(玉米ZeamaysAY167672)，Hv3GT(大麥HordeumvulgareX15694)，At3GT(擬南芥ArabidopsisthalianaAED92377)，Ph3GT(矮牽牛PetuniahybridaAB027454)。

Note：The same and similar amino acid residues are highlighted in black and gray, respectively. Underline indicates the PSPGbox found in glycosyltransferases.

用MEGA6.0將葡萄風(fēng)信子Ma3GT氨基酸與其他物種GT氨基酸(包括3GT、5GT等)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示,Ma3GT氨基酸序列首先與小蒼蘭、荷蘭鳶尾的3GT聚為一支，再與玉米、大麥3GT聚為一類，而后與其他雙子葉植物3GT聚為一大類，而與其他類葡糖基轉(zhuǎn)移酶，如5GT的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。據(jù)此結(jié)果，再次說明Ma3GT屬于3GT成員，且屬于單子葉植物亞類，與單子葉觀賞植物小蒼蘭和荷蘭鳶尾3GT親緣關(guān)系最近。

2.3葡萄風(fēng)信子Ma3GT基因時(shí)空表達(dá)模式分析

以葡萄風(fēng)信子根、莖、葉及盛花期(S4)花的cDNA為模板，利用熒光定量PCR檢測(cè)Ma3GT基因在葡萄風(fēng)信子不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Ma3GT在藍(lán)色葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’花(S4)中高表達(dá)，在葉片中微量表達(dá)，而根和鱗莖中幾乎不表達(dá)(圖7)。說明Ma3GT基因在藍(lán)色葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’中為花特異表達(dá)的模式。此外，Ma3GT基因在白色葡萄風(fēng)信子‘白麗人’及粉色葡萄風(fēng)信子‘粉日出’各個(gè)組織中幾乎不表達(dá)。

以藍(lán)、白和粉色3個(gè)葡萄風(fēng)信子品種5個(gè)不同時(shí)期花cDNA為模板，熒光定量PCR檢測(cè)Ma3GT在不同花色葡萄風(fēng)信子不同花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果顯示(圖8)，在‘亞美尼亞’花中，Ma3GT在未著色的小花蕾時(shí)期(S1)幾乎不表達(dá),S2時(shí)期開始著色后Ma3GT表達(dá)量逐步迅速增加，到了完全著色的盛花期(S4)，Ma3GT的表達(dá)量到達(dá)頂峰，S5時(shí)期花開始衰敗后又有所下降。不同于‘亞美尼亞’，Ma3GT在‘白麗人’和‘粉日出’所有花發(fā)育時(shí)期幾乎不表達(dá)。在測(cè)定葡萄風(fēng)信子花青素苷物質(zhì)時(shí)還發(fā)現(xiàn)，藍(lán)色葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’不同時(shí)期的花蕾中均檢測(cè)到大量的飛燕草素3-O-葡萄糖苷、矮牽牛素3-O-葡萄糖苷及天竺葵素3-O-葡萄糖苷及其他類花青素苷衍生物，而‘白麗人’花中并未檢測(cè)到花青素3-O-葡萄糖苷物質(zhì)存在。推測(cè),Ma3GT基因表達(dá)與葡萄風(fēng)信子花青苷物質(zhì)，尤其是花青素3-O-葡萄糖苷的累積有密切的關(guān)系。

圖6 Ma3GT蛋白與其他物種的GT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖7 Ma3GT在‘亞美尼亞’不同組織部位的表達(dá)分析

注：不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。下圖同。

Note：Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level; similarly for the Fig. 8.

圖8 Ma3GT在3個(gè)葡萄風(fēng)信子品種5個(gè)花發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

注：S1為未著色的花蕾；S2為開始著色的花蕾；S3為完全著色未開放的花蕾；S4為完全開放的花蕾；S5為衰敗的花蕾。

Note：S1, Unpigmented flower bud; S2, Flower bud being Pigmented; S3, Pigmented flower bud just before bloom; S4, Fully-opened flower bud; S5, Declined flower bud.

3 討論與結(jié)論

糖基化是重要的花色修飾過程，研究糖基化過程中重要的編碼酶：花青素3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)基因的功能，對(duì)于葡萄風(fēng)信子花色分子育種具有重要的意義。本研究在前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，采用PCR技術(shù)成功克隆到了單子葉觀賞植物葡萄風(fēng)信子的一條3GT基因(Ma3GT)cDNA全長(zhǎng)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Ma3GT氨基酸C末端包含了糖基轉(zhuǎn)移酶的PSPG保守序列。有研究表明,PSPG保守序列的第22、23和44位氨基酸殘基在酶蛋白糖基供體的選擇中具有重要作用。第22位若為色氨酸(Trp,W)可正確定位UDP-葡萄糖，而精氨酸(Arg,R)可正確定位UDP-葡萄糖醛酸;第23位的絲氨酸(Ser，S)在UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶中相對(duì)保守;第44位如果為谷氨酰胺(Gln，Q)，其糖供體為UDP-葡萄糖，而組氨酸(His，H)為UDP-半乳糖[22-24]。Ma3GT的第22、23和40氨基酸分別為Trp、Asn和Gln，因此可推測(cè)Ma3GT以UDP-葡萄糖為主要糖基供體。

早期人們對(duì)類黃酮的GTs進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)催化類黃酮3-O、5-O、7-O位置糖基化的GTs可形成三大進(jìn)化支(3GTs、5GTs和7GTs)[25]。Ma3GT與其他物種中GTs蛋白聚類分析表明，Ma3GT同催化類黃酮3-O位置糖基化的3GTs聚為一支，推測(cè)Ma3GT應(yīng)該參與了葡萄風(fēng)信子花色修飾過程中3-O位置的糖基化過程。同時(shí),它與單子葉觀賞植物小蒼蘭、荷蘭鳶尾3GT親緣關(guān)系最近。

有研究表明，3GT的表達(dá)活性與花青素苷的積累呈正相關(guān)，例如葡萄[26]、荔枝(Litchichinesis)[27]和箭葉淫羊藿(Epimediumsagittatum)[23]中，花青素苷大量積累的組織檢測(cè)到3GT高表達(dá)，而在少量積累和無花青素苷積累的組織中，3GT表達(dá)量極低或不表達(dá)。在本研究中，Ma3GT的表達(dá)也呈現(xiàn)相似的結(jié)果。在藍(lán)色品種‘亞美尼亞’中，盛開期的藍(lán)色花中Ma3GT高表達(dá)，葉片中有少量的表達(dá)，根、鱗莖幾乎檢測(cè)不到表達(dá)，說明Ma3GT在花青素苷大量積累的花中高表達(dá)，在該品種中具有花組織特異表達(dá)的模式。類似于小蒼蘭Fh3GT1[5]和草莓Fa3GT[28]，Ma3GT的轉(zhuǎn)錄水平受發(fā)育調(diào)控，在未著色時(shí)期花蕾呈現(xiàn)綠色時(shí),無Ma3GT的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，隨著花的逐漸發(fā)育，花青素苷的積累越來越多，至花蕾完全開放的時(shí)期，Ma3GT的表達(dá)達(dá)到最高峰。此外，Ma3GT在不同花色的葡萄風(fēng)信子品種中轉(zhuǎn)錄表達(dá)不同，在藍(lán)色花品種中高表達(dá)，而在白色花中幾乎不表達(dá)，此結(jié)果與小蒼蘭[5]中的報(bào)道相似。而Ma3GT在粉色品種‘粉日出’5個(gè)不同時(shí)期的花中表達(dá)量類似于未著色的白色品種‘白麗人’，推測(cè)‘粉日出’中雖有少量的花青素苷存在使其著色，但無花青素3-O-葡萄糖苷物質(zhì)存在，故無參與葡萄糖花青素3-O位置的糖基化過程的Ma3GT轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

總之，本研究在葡萄風(fēng)信子藍(lán)色品種‘亞美尼亞’中克隆了一條Ma3GT基因，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)、聚類分析和蛋白功能預(yù)測(cè)，分析了Ma3GT在葡萄風(fēng)信子不同組織、花色品種5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究Ma3GT基因在葡萄風(fēng)信子花瓣呈色中的功能及其花色分子育種提供基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Cloningandexpressionanalysisofanthocyanidin3-O-glucosyltransferasegeneinGrapehyacinth

Du Ling-juan1,2, Chen Kai-li1,2, Liu Ya-li1,2

(1.College of Landscape Architecture and Arts, Northwest A amp; F University, Yangling 712100, Shaanxi, China; 2.State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China, Northwest A amp; F University, Yangling 712100, Shaanxi, China)

Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase (3GT) is the last key enzyme in the anthocyanin biosynthetic pathway, which can catalyze unstable anthocyanidin into anthocyanin. In this study, we cloned a 3GT gene (designated asMa3GTfromMuscariarmeniacum) using the PCR technique. The gene’s cDNA was 1 377 bp long and encoded an open reading frame of 458 aminoacids.Ma3GTshowed 55%～64% similarity with the other 3GTs. Phylogenetic analysis indicated that Ma3GT was classified into monocot subgroups of 3GTs, and had the closest relationship with the 3GTs ofFreesiahybridandIrishollandica. QRT-PCR analysis detected transcripts ofMa3GTin different organs ofM.armeniacum. The expression level of this gene was high in the fully opened petals (stage S4), very low in the leaves, and almost zero in the roots and bulbs ofM.armeniacum. Andit almost had no expression in all the organs ofM.aucheri‘White Beauty’ andM.armeniacum‘Pink Surprise’. The gene expression was related to the floral developmental stages inM.armeniacum. The transcript level was rarely detectablein the unpigmented buds (stage S1), but increased during the pigment accumulation stages and peaked in the fully opened petals (S4). The expression had significant differences in three cultivars of different colors. The expression level was high in the petals ofM.armeniacum, and rarely detectable in the petals of ‘White Beauty’ and ‘Pink Surprise.’ This research will provide informationand theoretical support for the functional study of theMa3GTgene.

Muscari; anthocyanin;Ma3GTgene; RT-PCR; glucosyltransferase; glycosylation; flower color

Liu Ya-li E-mail:lyl6151@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0049

杜靈娟,陳凱利,劉雅莉.葡萄風(fēng)信子花青素3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及其表達(dá)分析.草業(yè)科學(xué),2017,34(11)：2235-2244.

Du L J,Chen K L,Liu Y L.Cloning and expression analysis of anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase gene in Grape hyacinth.Pratacultural Science，2017,34(11)：2235-2244.

Q943.2

A

1001-0629(2017)11-2235-10

2016-12-19接受日期2017-03-20

陜西省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(2017JQ3019)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(Z109021603)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31700625)

杜靈娟(1980-)，女，河南孟州人，講師，博士，主要從事園林植物分子育種研究。E-mail:9511083@qq.com

劉雅莉(1960-)，女，陜西西安人，教授，碩士，主要從事園林植物分子育種研究。E-mail:lyl6151@126.com