潘軍英,王浩飏，顏 妮，王 軍，丁玉鑫，宋仲濤,周海純

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

頭穴叢刺聯(lián)合湯藥對腦缺血大鼠影響的對比研究*

潘軍英1,王浩飏1，顏 妮1，王 軍1，丁玉鑫1，宋仲濤1,周海純2△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：對比研究頭穴叢刺聯(lián)合經(jīng)驗方治療腦缺血大鼠的作用及機(jī)制。方法：選取健康大鼠隨機(jī)分組，預(yù)標(biāo)記48 h后行MCAO造模，治療方法采用頭穴叢刺聯(lián)合補(bǔ)陽還五湯原方及頭穴叢刺聯(lián)合加味經(jīng)驗方分組治療。在各時間點(diǎn)分別處死取材，以神經(jīng)功能評定、行為學(xué)評定、病理學(xué)檢查和Western blot分別測定Hes5蛋白指標(biāo)，對比研究，觀察頭穴叢刺聯(lián)合加味經(jīng)驗方對模型大鼠NSC的影響。結(jié)果：經(jīng)過大量處方篩選發(fā)現(xiàn)，頭穴叢刺聯(lián)合補(bǔ)陽還五湯傳統(tǒng)組方在加入醉魂藤、走馬芹、鉆稈蟲等藥材后，在神經(jīng)功能評分、行為學(xué)功能評分方面兩種治療方法治療腦缺血大鼠均有作用，但加味經(jīng)驗方作用更佳(P<0.05)。檢測腦組織含水量在梗死周邊區(qū)的表達(dá)Hes5蛋白，指標(biāo)發(fā)現(xiàn)兩種治療方法治療腦缺血大鼠均有作用，但加味經(jīng)驗方組作用更佳(P<0.01)。結(jié)論：頭穴叢刺聯(lián)合補(bǔ)陽還五湯傳統(tǒng)組方加入醉魂藤、走馬芹、鉆稈蟲等藥材后作用最佳，其作用機(jī)制可能是參與影響腦梗死后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化。

頭穴叢刺；針刺療法；神經(jīng)干細(xì)胞；補(bǔ)陽還五湯

腦缺血是由腦血管血液循環(huán)不暢或供血不足導(dǎo)致的大腦局部缺血性疾病，占腦卒中患者比例的85%左右。腦缺血屬于臨床高發(fā)性腦血管疾病，在全球各國均具有極高的發(fā)病率，且具有復(fù)發(fā)率高、死亡率高的特點(diǎn)[1]。由于該病極易導(dǎo)致神經(jīng)損傷，引發(fā)面癱、半身不遂、癲癇甚至導(dǎo)致勞動力喪失，因此已成為嚴(yán)重影響我國中老年患者生存質(zhì)量的常見疾病和多發(fā)疾病[2]。

補(bǔ)陽還五湯由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、桃仁、紅花、川芎、地龍配制而成，初見于王清任的《醫(yī)林改錯》，影響深廣[3]，是中醫(yī)著名的傳統(tǒng)理血劑，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之功效，主治氣虛血瘀證、半身不遂、口眼斜、語言謇澀、口角流涎[4]。經(jīng)臨證加減，臨床治療腦缺血的有效率達(dá)40%～80%。

但現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，補(bǔ)陽還五湯用于治療腦缺血時，其組方仍存在不合理之處。但關(guān)于補(bǔ)陽還五湯如何進(jìn)行組方優(yōu)化，以提高對腦缺血的療效，仍存在爭議。部分研究者認(rèn)為加大方中黃芪有利于提高對腦缺血的療效；而部分研究者經(jīng)過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟鸱椒治鰟t發(fā)現(xiàn)，方中黃芪作為補(bǔ)氣成分對腦缺血無治療作用，因此認(rèn)為應(yīng)當(dāng)加大活血祛瘀組分(當(dāng)歸尾、赤芍、桃仁、紅花、川芎)的用量[5]。頭穴叢刺目前臨床已經(jīng)進(jìn)行了大量研究，證明能使腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的興奮性得到改善，使抑制性泛化得以糾正，能夠促進(jìn)可逆性神經(jīng)細(xì)胞復(fù)活，使被抑制的神經(jīng)細(xì)胞覺醒，改善缺血性半暗帶的局部神經(jīng)元的低氧超極化狀態(tài)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、分化能力，使得神經(jīng)功能盡快恢復(fù)。臨床醫(yī)生經(jīng)常針?biāo)幉⒂茫饔脙?yōu)于單法。

鑒于此，目前仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化研究，以提高其對腦缺血的治療作用。

1 材料與方法

1.1 造模

健康雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量為(180±20)g，實驗動物來源由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號：00101006。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF實驗室。采用線拴法制備大鼠大腦中動脈缺血性腦梗死模型。

預(yù)標(biāo)記48 h后參照Zea Longa等建立的大鼠大腦中動脈內(nèi)栓線阻斷方法，行大腦中動脈阻塞術(shù)(MCAO)。

1.2 模型分組

選擇實驗動物，一般情況良好時，開始進(jìn)行實驗，分為假手術(shù)組(Sham-OP)、模型組(MCAO)、頭穴叢刺聯(lián)合補(bǔ)陽還五湯原方組(MCAO+LFA)和頭穴叢刺聯(lián)合補(bǔ)陽還五湯加味組(MCAO+HFA)，每組15只。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。

1.3 抗體

Hes5 (A-17) 抗體 (Santa Cruz Biotechnology，# sc-13859);Hes5兔源多克隆抗體(cam公司，#194111);β-Actin (13E5) Rbit m (CST公司，貨號#4970)。

1.4 治療方法

1.4.1 方劑制備 補(bǔ)陽還五湯及加味補(bǔ)陽還五湯藥材均購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院草藥局。補(bǔ)陽還五湯方按原方組成:黃芪:當(dāng)歸尾:赤芍:地龍:川芎:桃仁:紅花=40∶2∶1.5∶1∶1∶1∶1。方劑制備予清水浸泡30 min。第一煎加藥材及5倍體積雙蒸水，煎汁60 min。二煎5倍體積雙蒸水，煎汁60 min。兩煎混勻，濃縮為總方2.68 g/ml，冷藏備用。

補(bǔ)陽還五湯加味方依據(jù)補(bǔ)陽還五湯原方用量比例，按原方組成:黃芪∶當(dāng)歸尾∶赤芍∶地龍∶川芎∶桃仁∶紅花=40∶2∶1.5∶1∶1∶1∶1，再按比例加上醉魂藤、走馬芹、鉆稈蟲各1.5，方劑制備方法同前。

1.4.2 頭穴叢刺 取穴:依據(jù)“大鼠穴位圖譜”，選取百會穴及百會穴左、右側(cè)各旁開2 mm處3個穴位。刺法:采用頭穴叢刺長留針法針刺，針刺方向為向眼的方向，刺入深度為沿皮平刺大約3 mm。手法:快速捻轉(zhuǎn)行針5 min，后留針6 h，每日1次，共治療2周。

1.5 治療方案

1.5.1 模型組 術(shù)后另置單獨(dú)普通籠中常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何治療，給予等體積雙蒸餾水。

1.5.2 原方組 給藥量按照人體和動物的體表面積進(jìn)行折算，大鼠以體重250 g計算，折算后給藥量約為每天5 g/kg。每日灌胃給藥2次。

1.5.3 加味組 予加味補(bǔ)陽還五湯灌胃給藥治療。給藥方法同原方組。

1.5.4 假手術(shù)組 只進(jìn)行分離動脈，不予結(jié)扎插線手術(shù)，術(shù)后常規(guī)單組飼養(yǎng)，給予等體積雙蒸餾水并標(biāo)記。

1.6 神經(jīng)功能評定

模型大鼠建立成功24 h后，參照Bederson 4級評分標(biāo)準(zhǔn)在治療前、治療后7天、14天分別對各組大鼠進(jìn)行評分[7]。

1.7 行為學(xué)功能測驗

對各組大鼠在治療前、治療后7天、14天進(jìn)行行為學(xué)功能測驗[6-7]，觀察大鼠行為學(xué)方面存在的差異。行為學(xué)功能測驗過程中，每只大鼠反復(fù)操作兩次，對兩次得分進(jìn)行比較，取高分記為測驗分值。實驗環(huán)境要求室溫、安靜、整潔。

1.8 Western Blot檢測

操作：蛋白質(zhì)膜上轉(zhuǎn)移。檢測：已知表達(dá)蛋白，抗體檢測。檢測：Western免疫印跡(Western Blot)是首先通過實驗操作實現(xiàn)樣品蛋白的膜轉(zhuǎn)移，成功之后選擇相應(yīng)抗體對樣品蛋白進(jìn)行檢測。

抗體選擇：已知表達(dá)蛋白選擇相應(yīng)對應(yīng)抗體實現(xiàn)一抗檢測；新基因的表達(dá)產(chǎn)物選擇融合部分的抗體檢測。

采用融合部分的抗體針對新基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)檢測?；静襟E：步驟一：檢驗樣品制備保存;步驟二：樣品電泳分離實驗;步驟三：樣品蛋白的膜轉(zhuǎn)移;步驟四：免疫雜交顯色檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

假手術(shù)組神經(jīng)功能評定、行為學(xué)功能測驗數(shù)值接近正常，與模型組有較大差異，僅用于驗證造模成功，故未錄入數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2.1 神經(jīng)功能評定

實驗結(jié)果顯示:針?biāo)幏ㄔ谥委?天、14天后對于缺血性中風(fēng)大鼠動物模型的神經(jīng)功能恢復(fù)效果顯著(P<0.05或P<0.01)，且加味補(bǔ)陽還五湯療效明顯優(yōu)于補(bǔ)陽還五湯原方療效(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠在不同時間點(diǎn)神經(jīng)功能評分的比較

注：與模型組比較,①P>0.05,②P<0.05,③P<0.01；與原方組比較，④P<0.05

2.2 行為學(xué)功能測驗

實驗結(jié)果顯示:針?biāo)幏ㄔ谥委?天、14天后對于缺血性中風(fēng)大鼠動物模型的行為學(xué)功能恢復(fù)效果顯著(P<0.01)，且加味補(bǔ)陽還五湯療效明顯優(yōu)于補(bǔ)陽還五湯原方療效(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠在不同時間點(diǎn)行為學(xué)功能評分的比較

注：與模型組比較,①P>0.05,②P<0.05,③P<0.01;與原方組比較，④P<0.05

2.3 病理形態(tài)學(xué)表達(dá)

假手術(shù)組腦神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腦組織未見充血壞死，未見血管出血表現(xiàn);模型組血細(xì)胞浸潤出血明顯，腦神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，可見細(xì)胞死亡;原方組腦血管見明顯充血及出血，腦神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，可見細(xì)胞死亡;加味組可見腦組織壞死灶，殘存少量膠質(zhì)細(xì)胞，能夠發(fā)現(xiàn)格子細(xì)胞較多，邊緣壞死有過渡，呈現(xiàn)周圍神經(jīng)細(xì)胞固縮性壞死。見封三彩圖1。

2.4 Hes5蛋白表達(dá)及引物特異性檢測

引物特異性檢測采用融解曲線法，實驗結(jié)果顯示:神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，Hes5蛋白都存在表達(dá)；蛋白表達(dá)及融解曲線可以看出在腦梗死后7天，各組Hes5蛋白表達(dá)全部顯示到達(dá)高峰，各治療組于各時間點(diǎn)，Hes5蛋白表達(dá)均顯示較高水平，說明各種治療方法均有效，與模型組比較，具有顯著性差異；其中各個時間點(diǎn)加味組表達(dá)均高于原方組,具有顯著性差異(P<0.05)。見圖2、封三彩圖3和表3。

圖2 Hes5蛋白表達(dá)

表3 各組Hes 5蛋白表達(dá)

注：與模型組比較，BP<0.01;與原方組比較，bP<0.05

3 討論

目前已經(jīng)有大量研究報道證實了頭穴叢刺及補(bǔ)陽還五湯對NSC的增殖、遷移、分化具有促進(jìn)作用。但筆者在長期臨床實踐中觀察腦缺血患者單用原方作用并不十分理想，所以在臨床實踐工作中，常常針?biāo)幉⒂?，同時在補(bǔ)陽還五湯的原方基礎(chǔ)上加減變化[6-7]，在長期的實踐觀察中，筆者發(fā)現(xiàn)在臨證時加大活血力度，獲得療效較為理想，本次研究的價值及創(chuàng)新點(diǎn)是本研究的研究人經(jīng)過大量處方篩選發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯傳統(tǒng)組方在加入醉魂藤、走馬芹、鉆稈蟲等藥材后，對腦缺血大鼠的腦梗死面積及神經(jīng)功能評分的改善作用，治療效果與其它方法比較更為理想，但是，查閱大量文獻(xiàn)沒有找到相關(guān)報道進(jìn)行理論支持，所以筆者從事此次研究實驗，目的從分子水平，通過對比觀察，為我們的臨床實踐提供可靠地論證。

在實驗過程中遇到了諸多問題，方劑變方研究涉及的是一個典型的多因素多水平問題，對藥物組合治療方案進(jìn)行優(yōu)選，篩選對比研究，其作用已經(jīng)十分清晰，所以本研究設(shè)立補(bǔ)陽還五湯原方為對照組重復(fù)驗證其作用，本實驗在補(bǔ)陽還五湯的基礎(chǔ)上加入醉魂藤、走馬芹、鉆稈蟲等藥材，既具有臨床觀察證據(jù)，又存在現(xiàn)代藥理研究證據(jù)，兩者均能抗腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可以有效抑制腦缺血再灌注后腦中谷氨酸、天門冬氨酸及 GA含量的異常升高，減輕腦缺血神經(jīng)元的損害，起到腦保護(hù)的作用，其作用機(jī)制也具有一定基礎(chǔ)。然而中藥方劑受各種因素影響，比如方劑中各種藥物的配伍劑量，君臣佐使的配伍方法均存在著非常復(fù)雜的交互作用，方劑給藥途徑有口服灌腸等，各種給藥方法也會對藥物的吸收存在影響，中醫(yī)時令服藥的給藥時間，理論上也會影響藥物的治療效果[8-9]，綜上這些作用影響存在協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng)。此次試驗為了驗證加味補(bǔ)陽還五湯的臨床觀察結(jié)果，在宏觀評分及微觀分子RNA水平進(jìn)行了量化比較，本次研究仍然沒有足夠基礎(chǔ)進(jìn)行定量配伍劑量及君臣佐使的配伍方法分析，沒有足夠基礎(chǔ)對藥物間交互作用的性質(zhì)(協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng))進(jìn)行分析，未對中藥組合之間的作用機(jī)制進(jìn)行深入探討[10]。只是依據(jù)臨床經(jīng)驗在臨床常用劑量基礎(chǔ)上調(diào)整，所以本研究只是為了提高腦缺血的臨床療效，采用頭穴叢刺聯(lián)合加味補(bǔ)陽還五湯經(jīng)驗方的一次初步研究，在今后的系列研究中，筆者將對本次未完成的內(nèi)容進(jìn)行更深一步的研究，期待得出更加系統(tǒng)的各種基本數(shù)據(jù)和信息，為其在臨床的使用貢獻(xiàn)一份力量。

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ComparativeStudyofScalpClusteringAcupunctureCombinedwithDifferentMedicationsinCIRats

PANJun-ying1,WANGHao-yang1,YANNi1,WANGJun1,DINGYu-xin1,SONGZhong-tao1,ZHOUHai-chun2△

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China)

Objective：To explore the effect and the mechanism of scalp clustering acupuncture combined with empirical formula in the treatment of cerebral ischemia(CI) in rats.MethodsMCAO was used to establish the models. The CI rats were randomly divided into group A(scalp clustering acupuncture+Buyang Huanwu decoction) and group B(scalp clustering acupuncture + empirical formula). Empirical formula was modified on the basis of Buyang Huanwu decoction, in which Zuihunteng(AsclepiadaceaeHeterostemmaalatum), Zoumaqin(Angelicadahurica), and Zuanganchong(Grain insects) were used. Evaluation of neurological function, assessment of behavior, examination of pathology, and expression of Hes5 protein were compared between the two groups to explore the effect and relative mechanism.ResultsIn terms of the scores of neurological function evaluation and behavior assessment, they were both elevated in the two groups; however, group B had better results(P<0.05). In terms of the expression of Hes5 protein around infarction border, it proved both treatments had therapeutic effects; treatment applied in group B was better(P<0.05).ConclusionThe therapy of scalp clustering acupuncture combined with modified empirical formula is more effective in treating CI rats, which mechanism may be related to its intervention in proliferation, migration, and differentiation of neural stem cell after cerebral infraction.

Scalp culstering acupuncturep; Acupuncture therapy; Neural stem cell; Buyang Huanwu decoction

R246.6

A

1005-0779(2017)11-0062-04

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃“優(yōu)秀青年教師支持人選”項目,編號：2012RCQ05；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)科研基金面上項目，編號：201722。

潘軍英(1981-),男，主治醫(yī)師，從事針灸推拿臨床工作。

△

周海純(1980-)，男，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事針灸臨床工作。

2017-05-22