鄭 敏

（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

正交試驗(yàn)法優(yōu)選肝腎滋總多糖提取工藝

鄭 敏

（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

目的 優(yōu)選肝腎滋總多糖的最佳提取工藝。方法 以總多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選肝腎滋總多糖的最佳提取工藝。結(jié)果 肝腎滋總多糖的最佳工藝條件為，浸泡1h，加10倍量水，回流2h，提取2次。結(jié)論 該提取工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，可用于肝腎滋總多糖的提取。

肝腎滋；總多糖；提取工藝；正交設(shè)計(jì)

肝腎滋收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二冊(cè)）》[1]，是由枸杞子、黃芪、黨參、麥冬和阿膠制成的煎膏劑，具有益肝明目、滋陰補(bǔ)腎的功效，主要用于腎陰不足、氣血兩虧、目眩昏暗、心煩失眠、肢倦乏力、腰腿酸軟等癥。由于該制劑規(guī)范年代已久，制劑工藝參數(shù)不明確，為保證制劑質(zhì)量，本研究中根據(jù)方中枸杞子、黃芪、黨參、麥冬均含有多糖的化學(xué)成分及理化性質(zhì)，結(jié)合處方的功能主治，以總多糖含量為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，采用水煎煮法，以及 L9（34）正交試驗(yàn)法對(duì)影響肝腎滋提取工藝的主要因素進(jìn)行優(yōu)選?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV－2450型可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；AL204型十萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司）；RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DF－101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥

枸杞子（批號(hào)為20161109）為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實(shí)，黃芪（批號(hào)為20161019）為豆科植物蒙古黃芪 Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.Var.mongholicus（Bge.） Hsiao 或膜莢黃芪 Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，黨參（批號(hào)為20161120）為桔梗科植物黨參 Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.、素花 黨參 Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen 或川黨參 Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，麥冬（批號(hào)為 20161109）為百合科植物麥冬 Ophiopogon japonicus（L.f）Ker－ Gawl.的干燥塊根，均購(gòu)自安國(guó)義通中藥材有限公司，經(jīng)我院中藥鑒定室劉斌高級(jí)工程師鑒定，均符合2015年版《中國(guó)藥典(一部)》相關(guān)規(guī)定。D－葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為 110625－200911，純度為98%）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總多糖含量測(cè)定方法的建立

2.1.1對(duì)照品溶液制備

稱取105℃干燥至恒重的 D－葡萄糖對(duì)照品21.00 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL中含 D－葡萄糖0.21mg）。

2.1.2測(cè)定波長(zhǎng)選擇

取對(duì)照品溶液，在450～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果在489 nm波長(zhǎng)處有最大吸收（圖1），故含量測(cè)定選擇489 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 溶液紫外吸收光譜圖

2.1.3方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取對(duì)照品溶液 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分別置 10 mL 具塞刻度試管中，加蒸餾水至2.0 mL，搖勻，冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮－硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10 min，取出，然后立即置冰水浴中冷卻10 min，取出，以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照溶液。照紫外－可見分光光度法[《中國(guó)藥典(二部)》附錄ⅤA]，在489 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為 Y＝2.602 42 X－0.312 38，R2＝0.998 9(n＝6）。結(jié)果表明，D －葡萄糖對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在0.021～1.26 g／L范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：吸取同一批樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果總多糖吸光度的 RSD為1.12%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

白煞離開聚賢廳去廂房告訴獨(dú)自盤坐調(diào)息的黑煞蕭飛羽所言。黑煞也怔忡起來，好一會(huì)他就像踏上了一條不知?dú)w期的旅途彷徨喃喃：“我犯了一個(gè)無法饒恕的錯(cuò)誤，因?yàn)槲揖谷粵]有想到武功堡殘余因?yàn)闅Ъ覝玳T之恨，無論走還是留都會(huì)非常努力拖安和莊下水?！?/p>

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于顯色后0，30，60，90，120，180 min 時(shí)依法測(cè)定吸光度。結(jié)果的RSD為1.89%（n＝6），表明供試品溶液在顯色180 min內(nèi)穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn)：取同一 D－葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL，依法測(cè)定吸光度，平行操作 6次。結(jié)果的 RSD為1.15%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品提取液0.25 mL，共6份，分別加入 D－葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL，用蒸餾水定容至 2 mL（其中對(duì)照品的理論量應(yīng)為 105 μg），依法測(cè)定吸光度，計(jì)算含量及回收率。結(jié)果見表1。

表1 多糖加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.1.4樣品制備與含量測(cè)定

按處方比例，精密稱定粉碎（過3號(hào)篩）的枸杞子16 g，黃芪 0.4 g，黨參 2 g，麥冬 1 g，各取 9 份，置圓底燒瓶中，加80%乙醇回流，將各提取液過濾，精密量取續(xù)濾液5 mL置50 mL離心管中，加20 mL無水乙醇，混勻，離心10 min，將上層乙醇液棄去，用少量無水乙醇清洗離心管，并棄去乙醇液，待離心管晾干后，加入少量熱蒸餾水，將多糖全部化開，置50 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，精密量取其液5 mL置50 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻作為供試品溶液。精密量取供試品溶液2mL，置10 mL具塞干燥試管中，自“加蒸餾水至2.0 mL”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含D－葡萄糖的質(zhì)量（mg），計(jì)算含量，即得。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1因素水平確定

選取浸泡時(shí)間（因素 A）、加水量（因素 B）、提取時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）作為考察因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平表見表2。

表2 因素水平表

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及方差分析，結(jié)果表明，各因素之間均無顯著性差異。各因素對(duì)提取工藝的影響規(guī)律為 C＞D＞A＞B，加水量對(duì)提取多糖量影響最明顯。因此提取多糖的最佳條件為A2B3C3D2，即浸泡1 h，加10倍量水，回流2 h，提取2次。詳見表3和表4。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

以正交試驗(yàn)得到的最佳工藝條件提取3次，結(jié)果總多糖的提取率分別為49.1%，45.6%和44.9%，多糖平均得率為46.5% 。結(jié)果與預(yù)測(cè)一致，表明正交試驗(yàn)得到的最佳提取條件重復(fù)性好。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，各因素對(duì)提取工藝的影響強(qiáng)度依次為C＞D＞A＞B，加水量對(duì)提取多糖量影響最明顯。通過直觀分析方法，篩選出提取多糖的最佳工藝條件為 A2B3C3D2，即浸泡 1 h，加 10倍量水，回流 2 h，提取2次。該提取工藝穩(wěn)定，提取率高。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，肝腎滋產(chǎn)品良好的功效主要來源于各味藥材的多糖成分，如黃芪多糖具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、促進(jìn)抗體生成、促進(jìn)免疫、雙向調(diào)節(jié)血糖和保護(hù)心血管系統(tǒng)等作用[2－3]。枸杞多糖主要用于增強(qiáng)免疫、延緩衰老[4]、降低血糖[5－6]、促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)合成[7]，并具有抗腫瘤[8]、治療心血管疾病等作用。黨參多糖是黨參主要的有效成分之一，研究表明，黨參多糖具有抗腫瘤[9]、提高免疫力[10]、抗氧化和抗衰老作用[11]，具有重要的開發(fā)價(jià)值。麥冬多糖也同樣具有多方面的活性，如對(duì)心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗腫瘤、變態(tài)反應(yīng)、非過敏性哮喘、抗輻射、抗疲勞等方面的作用[12]。

本試驗(yàn)中通過正交設(shè)計(jì)對(duì)肝腎滋中總多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用紫外分光光度法對(duì)優(yōu)化工藝中的總多糖量進(jìn)行檢測(cè)，為肝腎滋多糖新劑型的研制提供了科學(xué)依據(jù)，為后期多糖產(chǎn)品開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第二冊(cè)）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：115 －116.

[2]蔡 莉，朱 江.黃芪多糖研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中國(guó)腫瘤臨床，2007，34（15）：896 － 900.

[3]艾連中，吳 艷，郭本恒，等.黃芪多糖的研究進(jìn)展[J].山東食品發(fā)酵，2008（1）：39 －41.

[4]董淑楠，朱柯蕙，印 虹，等.枸杞多糖的理化性質(zhì)及其免疫調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2013，8（1）：66 －68.

[5]譚淑敏.枸杞降血糖作用的藥效學(xué)研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28（11）：2103 － 2104.

[6]丁 園.枸杞多糖對(duì)2型糖尿病大鼠血糖、血脂的影響[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，36（5）：12 － 14.

[7]李曉冰，陳玉龍，展俊平，等.枸杞多糖對(duì)糖尿病大鼠血糖水平及機(jī)體免疫功能的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2013，16（27）：3028－3210.

[8]李卓能，張 靖，周敦金，等.枸杞多糖對(duì)人前列腺癌DU－145細(xì)胞株體外抗腫瘤作用[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2013， 24（5）：3 － 6.

[9]楊 瑾，劉杰書，袁德培.黨參多糖體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)處方藥，2014，12（3）：25 － 26.

[10]晏永新，張 麗，賈海芳，等.黨參多糖口服液對(duì)小鼠免疫功能的影響[J].中國(guó)獸藥雜志，2013，47（3）：18 －20.

[11]郭曉農(nóng)，戚歡陽(yáng)，王 兵，等.黨參多糖對(duì)衰老模型小鼠的抗衰老作用[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2013，33（21）：5371 －5372.

[12]曹 爽，付紹智，王永多，等.麥冬多糖藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（28）：63 －66.

Optimization of Extraction Process of Total Polysaccharides from Ganshenzi by Orthogonal Test

Zheng Min
（ Inner Mongolia People′s Hospital， Hohhot， Inner Mongolia， China 010010）

Objective To optimize extraction processof totalpolysaccharidesfrom Ganshenzi.M ethods With the content of total polysaccharide as the evaluation index，the optimum extraction process of total polysaccharides from Ganshenzi was optimized by orthogonal test.Results The optimum process conditions of total polysaccharide of Ganshenzi were soaking 1 h，adding water 10 times，refluxing 2 h，extracting 2 times.Conclusion The extraction process is simple and stable，which can be used for the extraction of total polysaccharides from Ganshenzi.

Ganshenzi；total polysaccharides；extraction process；orthogonal design

TQ460.6；R284.1

A

1006－4931(2017)22－0018－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.22.006

鄭敏，女，大學(xué)本科，副主任藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)，（電子信箱）454962527＠qq.com。

2017－06－06)