鄒桂欣 ，孫小玲 ，王光函 ，尤獻(xiàn)民，李國(guó)信

（1.遼寧省中醫(yī)研究院，遼寧 沈陽 110034； 2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧 沈陽 110023）

鳶尾甲黃素A對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞分泌炎性因子的調(diào)節(jié)作用

鄒桂欣1，孫小玲2，王光函1，尤獻(xiàn)民1，李國(guó)信1

（1.遼寧省中醫(yī)研究院，遼寧 沈陽 110034； 2.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧 沈陽 110023）

目的 研究射干中鳶尾甲黃素A對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌炎性因子一氧化氮（NO）和白細(xì)胞介素6（IL－6）的調(diào)節(jié)作用。方法 采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，建立細(xì)胞炎性反應(yīng)模型。用不同質(zhì)量濃度的鳶尾甲黃素A進(jìn)行干預(yù)，并設(shè)立空白對(duì)照組。通過噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定不同質(zhì)量濃度鳶尾甲黃素A對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響，Griess法檢測(cè)NO生成量，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中炎性因子IL－6的含量。結(jié)果 鳶尾甲黃素A能明顯抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞生成NO和IL－6，且作用強(qiáng)度呈濃度依賴性。結(jié)論 鳶尾甲黃素A的抗炎作用可能與減少炎性因子NO和IL－6的生成有關(guān)。

鳶尾甲黃素A；脂多糖；RAW264.7細(xì)胞；一氧化氮；白細(xì)胞介素6；小鼠

射干是鳶尾科植物射干 Belamcandachinensis（L）.DC.干燥根狀莖，主含異黃酮類化合物[1]，包括射干苷、野鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素[2－3]、鳶尾甲黃素B、鳶尾甲黃素A等成分[4]，具有明顯的抗炎作用[5]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)軟件（http： ／／TCMSPnw.com ／default）對(duì)射干藥材中黃酮類成分進(jìn)行口服利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug－likeness，DL）分析，結(jié)果鳶尾甲黃素A綜合得分最高，OB值約為64%，提示口服利用度良好；DL值為0.4，表明成為候選藥物的可能性較大（當(dāng)化合物的 DL≥0.18時(shí)即可作為候選藥物）。但目前對(duì)鳶尾甲黃素A藥理活性的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。本研究中以脂多糖（LPS）刺激的小鼠RAW264.7細(xì)胞為炎癥模型，觀察鳶尾甲黃素A對(duì)炎性因子一氧化氮（NO）和白細(xì)胞介素6（IL－6）作用的影響，在細(xì)胞水平上探討鳶尾甲黃素A的抗炎機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1儀器

W－CJ－1B型標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；CB150CE3型二氧化碳（三氣）培養(yǎng)箱（路易企業(yè)有限公司）；XDS－500C型倒置顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；400C型離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)柏騰儀器有限公司）；HH－S210R4型電熱恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司）；Y－LS－50A型立式壓力蒸汽消毒器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.1.2試藥

DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素（Hyclone公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；乙二胺四乙酸(EDTA)、噻唑藍(lán)(MTT）、LPS，Sigma 公司；二甲基亞砜(DMSO）、臺(tái)盼藍(lán)(Typan Blue），Amerseco 公司；小鼠 NO及IL－6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。鳶尾甲黃素A（江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)為20140724）。細(xì)胞株為小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。

1.2 方法

1.2.1藥物溶液配制

LPS溶液：取LPS粉末 5 mg，溶解在1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，制成質(zhì)量濃度為5 g／L的LPS溶液，使用前用含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋至2 μg／mL即可。

鳶尾甲黃素A藥液：取鳶尾甲黃素A適量，加DMSO溶解，用 PBS 稀釋成質(zhì)量濃度為 352，176，88，44，22，11，5.5 μg ／mL 的貯備液。

MTT 溶液：稱取 MTT 0.5 g，溶于 100 mL PBS 中，制成質(zhì)量濃度為5 g／L的MTT溶液。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞置高糖DMEM培養(yǎng)基中，并加入 10% 青霉素及鏈霉素 100 mg ／L，在 95%O2、5%CO2、37℃條件下傳代培養(yǎng)。

1.2.3MTT 試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，制得細(xì)胞濃度為每1 mL含1×105個(gè)的單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜；吸棄各孔培養(yǎng)液，分組處理，即鳶尾甲黃素 A組分別加入 352，176，88，44，22，11，5.5 μg／mL 7 個(gè)質(zhì)量濃度的藥液，LPS 模型組加 LPS（2 μg ／mL）溶液；空白對(duì)照組加含 10% 胎牛血清的EMDM培養(yǎng)液，每組平行5孔，各孔加液終體積為200 μL，在 5%CO2、37 ℃ 條件下繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；然后在各孔加入 20 μL MTT 的 PBS 水溶液（5 g／mL），培養(yǎng) 4 h；吸棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液150 μL振蕩溶解。使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD）值，計(jì)算各組細(xì)胞活力，并將空白對(duì)照組細(xì)胞活力記作100.00%；其他各組與對(duì)照組細(xì)胞的存活百分率進(jìn)行比較。

1.2.4Griess試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，制得細(xì)胞濃度為每1 mL含1×105個(gè)的單細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜；吸棄各孔培養(yǎng)液，分組處理，即給藥組分別加入 22，11，5.5 μg／mL 的 3個(gè)質(zhì)量濃度藥液，LPS模型組和空白對(duì)照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組平行5孔，各空加液體積為 200 μL，處理 1 h后，空白對(duì)照組加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，其他各組均加LPS（2 μg ／mL）溶液，每孔加液體積為 100 μL，在 5%CO2及37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；吸取各孔培養(yǎng)液 50 μL，加入等體積的Griess試劑，室溫反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定 OD值，依據(jù)所測(cè)亞硝酸鈉濃度，推算各組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量，從而計(jì)算各藥液組對(duì)LPS處理的細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制率。

1.2.5雙抗體夾心ELISA法試驗(yàn)

細(xì)胞分組及處理等設(shè)計(jì)同1.2.4項(xiàng)，各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，按照IL－6細(xì)胞因子的ELISA試劑盒說明書操作，吸取各孔培養(yǎng)液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過各組培養(yǎng)液中IL－6的含量計(jì)算抑制率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，組間數(shù)據(jù)比較采用 t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活力的影響

MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著鳶尾甲黃素A質(zhì)量濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞被抑制的效果越明顯。與空白對(duì)照組細(xì)胞存活率相比，藥物濃度在2.75～22 μg／mL范圍內(nèi)對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力基本不產(chǎn)生影響。鏡下觀察，細(xì)胞狀態(tài)良好，表明在此濃度范圍內(nèi)鳶尾甲黃素A無明顯細(xì)胞毒性作用。因此，選擇 22，11，5.5 μg ／mL 3個(gè)質(zhì)量濃度繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)（圖1）。

圖1 鳶尾甲黃素A對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

2.2 對(duì) LPS誘導(dǎo)小鼠 RAW264.7細(xì)胞分泌 NO的抑制

空白對(duì)照組細(xì)胞上清液中檢測(cè)到的NO濃度非常低，僅為 2.1 μmol／L。予 2 μg ／mL LPS 刺激后，巨噬細(xì)胞釋放大量的 NO （34.5 μmol／L），提示造模成功。與模型組相比，鳶尾甲黃素A作用的RAW264.7細(xì)胞上清液中，NO含量顯著減少，結(jié)果表明，質(zhì)量濃度在5.5～22 μg／mL范圍內(nèi)的鳶尾甲黃素A能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的 NO產(chǎn)生（圖2）。

2.3 對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞分泌IL－6的抑制

空白對(duì)照組細(xì)胞上清液中IL－6質(zhì)量濃度為190.2 pg／mL，給予 2 μg ／mL LPS 刺激后，巨噬細(xì)胞釋放 IL －6 的含量顯著增加（5 819.2 pg／mL）。而與模型組相比，鳶尾甲黃素A 3個(gè)劑量組均可顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放IL－6，且具有明顯的濃度依賴關(guān)系（圖3）。

圖2 鳶尾甲黃素A對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

圖3 鳶尾甲黃素A對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL－6的影響

3 討論

巨噬細(xì)胞是免疫效應(yīng)細(xì)胞，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用，也是體內(nèi)啟動(dòng)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的中心細(xì)胞。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，也是革蘭陰性菌的主要致病物質(zhì)，也是引起嚴(yán)重感染的直接原因[6]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，LPS通過MyD88分子等途徑激活NF－κβ，啟動(dòng)一系列細(xì)胞因子及其生物活性分子如NO，TNF－α，IL－6等，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放多種炎性因子參與反應(yīng)。結(jié)果顯示，2 μg／mL的LPS作用于RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為99.91%，表明對(duì)細(xì)胞無毒性作用，2 μg／mL 的 LPS RAW264.7 細(xì)胞與作用24 h后，NO和IL－6的釋放量與空白對(duì)照組有顯著性差異。因此，本試驗(yàn)中采用2 μg／mL的LPS作用于RAW264.7細(xì)胞。

NO是重要的天然免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)性效應(yīng)分子，參與血管調(diào)節(jié)、神經(jīng)傳遞、炎癥與免疫反應(yīng)等過程。NO由一氧化氮合酶（NOS）催化左旋精氨酸而產(chǎn)生，在病理情況下NO大量合成會(huì)引起急、慢性炎性反應(yīng)，誘發(fā)組織損傷和病變，進(jìn)而參與某些炎癥性疾病的發(fā)生[7]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，LPS模型組NO的分泌量增加；鳶尾甲黃素A各組的NO量均低于LPS模型組。

IL－6是近年來研究較多的一種多功能細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性和潛在的臨床應(yīng)用前景。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2 μg／mL的LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的IL－6，與空白對(duì)照組相比，有顯著性差異；而與模型組相比，質(zhì)量濃度在 5.5～22 μg／mL范圍內(nèi)的鳶尾甲黃素A能顯著抑制由 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放IL－6，并呈現(xiàn)良好的濃度依賴關(guān)系。

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Regulation EffectofIristectorigenin A on Secretion ofInflammatory Factor in Mouse RAW264.7 Cells Induced by Lipopolysaccharide

Zou Guixin1， Sun Xiaoling2， Wang Guanghan1， You Xianmin1， Li Guoxin1
（1.Liaoning Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Shenyang， Liaoning， China 110034； 2.Liaoning Provincial Institute for Drug Control and Inspection，Shenyang，Liaoning，China 110023）

Objective To investigate the regulation effect of iristectorigenin A on secretion of inflammatory factors （NO and IL －6） in mouse RAW264.7 macrophage cells induced by lipopolysaccharide（LPS）.Methods LPS was adopted to induce RAW264.7 macrophage cells in order to establish the model of cellular inflammatory response.Different concentrations of iristectorigenin A were used to intervene the RAW264.7 macrophage cells，and the blank control was set.The effects of different concentrations of iristectorigenin A on the viability of RAW264.7 cells were determined by MTT method，the production of NO was detected by Griess method，and the content of inflammatory factor（IL － 6） in cell supernatant was detected by ELISA.Results Iristectorigenin A can significantly inhibit the production of NO and IL －6 in RAW264.7 cells induced by LPS,and the concentration of the action was in a concentration dependent manner.Conclusion The anti－ inflammatory effect of iristectorigenin A may be related to the reduction of the production of inflammatory factors（NO and IL － 6）.

iristectorigenin A；lipopolysaccharide；RAW264.7 cell；NO；IL － 6；mouse

R285.5；R282.71

A

1006－4931(2017)22－0001－03

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.22.001

國(guó)家自然科學(xué)基金[81273927]；國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”項(xiàng)目[SQ2017ZX090328]。

鄒桂欣（1965－），女，研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)，（電子信箱）zou650430＠126.com。

李國(guó)信（1963－），男，博士研究生，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滤庨_發(fā)，（電子信箱）yying＿65＠126.com。

2017－06－06)