袁亞莉

（甘肅省隴西縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，隴西 748100）

青藏高原霍爾巴綿羊線粒體基因組研究

袁亞莉

（甘肅省隴西縣畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，隴西 748100）

利用重測序方法對青藏高原霍爾巴綿羊線粒體基因組進(jìn)行測序、組裝，并對基因特點(diǎn)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析。結(jié)果表明：霍爾巴綿羊線粒體基因組全長16 621 bp，該基因由13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因、2個(gè)核糖體RNA基因和1個(gè)非編碼控制區(qū)組成；基因特點(diǎn)顯示堿基A含量33.64%、T含量27.32%、C含量25.90%、G含量13.14%，A+T含量（61.96%）比G+C含量（39.04%）高，表現(xiàn)出一定的堿基偏好，轉(zhuǎn)換多于顛換，表現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)換偏向；基于線粒體基因組構(gòu)建了22個(gè)不同物種的NJ樹，表明霍爾巴綿羊與綿羊?qū)儆H緣關(guān)系最近，與牛屬和巖羊?qū)儆H緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

霍爾巴綿羊；基因組；線粒體；系統(tǒng)進(jìn)化

霍爾巴綿羊是在青藏高原惡劣氣候和特殊生境條件下，經(jīng)過長期自然選擇、閉鎖繁育，特別是近十多年的定向系統(tǒng)選育而形成的高原型肉毛兼用藏系綿羊地方類群，中心產(chǎn)區(qū)位于西藏自治區(qū)日喀則市仲巴縣霍爾巴鄉(xiāng)，目前存欄大約5萬只，平均活重35.50 kg，胴體重23.45 kg，剪毛量 2.00 kg，毛長 14.50 cm［1］。

高等動(dòng)物線粒體是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有較高的突變率和母系遺傳特征，特別適合種內(nèi)、種間及種以上分類階元的進(jìn)化研究［2］。鞏元芳等［3］用mtDNA基因研究了中國幾個(gè)地方綿羊品種線粒體多態(tài)性，表明我國地方綿羊品種的起源可能是單一的。管松等［4］研究了中國西南地區(qū)5個(gè)地方綿羊群體mtDNA遺傳多樣性，得出西藏綿羊有3個(gè)母系來源，云南綿羊有2個(gè)母系來源。因此，mtDNA基因可以作為一種遺傳標(biāo)記，用來研究綿羊的起源進(jìn)化以及親緣關(guān)系。本研究以霍爾巴綿羊?yàn)樗夭?，測定了其線粒體基因組序列，并進(jìn)行對比分析，以期為霍爾巴綿羊的起源分化及遺傳親緣關(guān)系的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

霍爾巴綿羊血液采自西藏藏族自治區(qū)日喀則市仲巴縣霍爾巴鄉(xiāng)扎次村（北緯 30°10′47″、東經(jīng) 83°10′09″，海拔4 468 m），所采全血樣為6 mL，EDTA抗凝，-20℃凍存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 霍爾巴綿羊血液基因組總DNA的提取按照天根生物有限公司動(dòng)物組織DNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與線粒體DNA基因片段的擴(kuò)增 用DNAMAN進(jìn)行比對，查出保守序列，利用primer 5設(shè)計(jì)引物，根據(jù)目的基因、pGM-T載體的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩端含有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的引物。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：霍爾巴綿羊DNA樣品1 μL（75 ng/μL），10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L 的 dNTP 2 μL，25 mmol/L MgCl21μL，正向引物和反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL（5 U/μL），加滅菌雙蒸水至25 μL。未加DNA樣品為陰性對照。反應(yīng)程序：94℃，2 min 預(yù)變性；94℃、60 s，44℃、60 s，72℃、90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。

1.2.3 純化與測序 用北京百泰克生物技術(shù)有限公司回收試劑盒進(jìn)行純化與回收，將mtDNA的PCR純化產(chǎn)物與pGM-T連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定，篩選陽性克隆，并命名為PGM-T-mtDNA。對陽性克隆進(jìn)行PCR和EcoR I酶切鑒定，對鑒定正確的質(zhì)粒送由上海生工進(jìn)行測序。

1.2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 運(yùn)用ClustalX軟件將測得序列進(jìn)行比對，輔以人工校正。利用MEGA 5.1軟件對霍爾巴綿羊mtDNA基因序列進(jìn)行種內(nèi)和種間差異評估［5-6］，用鄰接（neighbour-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度由1 000次自舉法（bootstrap）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA的組成及其變異特點(diǎn)

霍爾巴綿羊線粒體基因組的組成和注釋詳見表1和圖1?；魻柊途d羊線粒體基因組全長16 621 bp，該基因由13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因、2個(gè)核糖體RNA基因和1個(gè)非編碼控制區(qū)組成；基因特點(diǎn)顯示A含量33.64%、T含量27.32%、C含量25.90%、G含量13.14%，霍爾巴綿羊線粒體基因組的組成和其他哺乳動(dòng)物的組成是相似的［7-8］。A+T含量（61.96%）比G+C含量（39.04%）高，表現(xiàn)出一定的堿基偏好，轉(zhuǎn)換多于顛換，表現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)換偏向。13個(gè)蛋白編碼基因全長為11 402 bp，占整個(gè)線粒體基因組全長的68.60%；霍爾巴綿羊與大多數(shù)哺乳動(dòng)物一樣，線粒體基因組的編碼除了ND6和8個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因是從輕鏈開始編碼之外，其余都是從重鏈開始編碼的；13個(gè)蛋白編碼基因的起始密碼子除了ND2、ND3和ND5是ATA之外，其余的起始密碼子都是ATG；5個(gè)蛋白編碼基因（ND1，ND2，COX3，ND3 和 ND4）的終止密碼子是一個(gè)不完整的終止密碼子T（aa），然而細(xì)胞色素b基因（Cytb）的終止密碼子由AGA變?yōu)門AA，其余7個(gè)蛋白編碼基因的終止密碼子是典型的TAA。線粒體基因組控制區(qū)（D-Loop）位于tRNA-Phe和tRNA-Pro之間，全長為1 183 bp（從15 439 bp到16 621 bp），12S rRNA基因的全長為959 bp（從69 bp到1 027 bp），16S rRNA基因的全長為 1 576 bp（從 1 095到 2 670 bp）；22 tRNA基因的長度在60 bp到75 bp之間變化。

表1 霍爾巴綿羊線粒體基因組注釋

續(xù)表1

圖1 霍爾巴綿羊線粒體基因組注釋

2.2 霍爾巴綿羊系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用本實(shí)驗(yàn)測定的霍爾巴綿羊線粒體基因組序列以及從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的21個(gè)不同物種的線粒體基因組序列，通過MEGA 5.1軟件基于Kimura兩參數(shù)距離采用鄰位相接法（NJ），構(gòu)建22個(gè)不同品種的系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。結(jié)果表明，霍爾巴綿羊與綿羊?qū)儆H緣關(guān)系最近，與牛屬和巖羊?qū)儆H緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這與Hu等［9］、Lancioni等［8］和 Zhong 等［11］的研究結(jié)果一致。

圖2 基于線粒體基因組序列構(gòu)建的22個(gè)不同物種的NJ樹

3 結(jié)論

本研究對霍爾巴綿羊線粒體基因組進(jìn)行克隆測序，對其基因組成和序列變異特點(diǎn)進(jìn)行注釋和分析，初步構(gòu)建了25個(gè)不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹，研究結(jié)果表明，霍爾巴綿羊?qū)儆谝粋€(gè)獨(dú)立的地方綿羊品種。這為剖析霍爾巴綿羊線粒體基因組的遺傳特點(diǎn)和品種起源、分化及親緣關(guān)系提供了理論依據(jù)。

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The Complete Mitochondrial Genome Sequence of Huoerba Sheep in the Qinghai-Tibetan Plateau

Yuan Yali
（Technology Service Center of Animal Husbandry and Veterinary of Longxi County，Longxi 748100，Gansu，China）

Huoerba sheep，as a year-round grazing animal in the Qinghai-Tibetan plateau of China，is an excellent local breed and plays a vital role in promoting the economy development and livelihoods for native herders.In current study，gene resequencing of the complete mitochondrial genome sequence of Huoerba sheep was conducted for the first time，and the characteristics and phylogeny of the gene were analyzed.The results showed that the total length of the mitogenome was 16 618 bp which consisted of 13 protein-coding genes，22 transfer RNA（tRNA）genes，2 ribosomal RNA（rRNA）genes and 1 non-coding control region（D-loop region）.The characteristics of overall base composition were：A（33.64%），T（27.32%），C（25.90%），G（13.14%），A+T（61.96%）and G+C（39.04%）.The genes in which the transitions were more than transversions showed a certain base preference and higher biased gene conversion.The analyses of phylogenetic relationships based on the construction of the mitochondrial genomes of 22 different species of Neighbor-Joining tree indicated that Huoerba sheep had the closest genetic relationship with sheep but the most distant relationship was observed with Bos and Pseudois.This study provides useful data for further study on protection ofgenetic resources and the taxonomy of Caprinae.

Huoerba sheep；genome；mitochondrion；phylogenetic

S826.2

A

2095-3887（2017）06-0005-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.06.002

2017-08-02

袁亞莉（1976－），女，畜牧師，主要從事畜牧技術(shù)推廣服務(wù)工作。