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(廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,廣西南寧 530007)

基因組改組快速提高日本小球藻脂肪產(chǎn)量

劉紅全,袁莎,盧恩秋,潘藝華,楊海燕,龍寒,禤金彩,何秀苗

(廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院/廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,廣西南寧 530007)

以日本小球藻為出發(fā)藻株,經(jīng)過(guò)紫外線和甲基磺酸乙酯分別誘變處理,獲得4株總脂產(chǎn)量有所提高的突變株。以聚乙二醇作為融合劑,對(duì)獲得的突變株進(jìn)行兩輪遞歸式原生質(zhì)體融合,篩選到遺傳穩(wěn)定的改組藻株F2C2,其總脂含量為59.01%,較原始藻株提高了101.4%。對(duì)日本小球藻的原始藻株和改組藻株F2C2的油脂含量進(jìn)行分析,結(jié)果表明改組前后日本小球藻的總脂組成成分沒(méi)有變化,但各組分含量有較大差別。

基因組改組,總脂含量,日本小球藻

隨著全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展以及人口的快速增長(zhǎng),為降低化石能源資源的消耗,減少對(duì)環(huán)境的損害,尋求可再生的環(huán)境友好型能源已成為當(dāng)務(wù)之急[1]。微藻由于其細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、繁殖速率快、含油量高等特性,是生產(chǎn)生物乙醇的理想原料,成為第三代生物能源的典型代表。開發(fā)微藻生物乙醇具有廣闊的發(fā)展前景[2]。目前,限制微藻油脂產(chǎn)業(yè)化的主要障礙是成本較高,養(yǎng)殖效率遠(yuǎn)低于理論預(yù)期。其根本原因是現(xiàn)有藻種無(wú)法滿足生產(chǎn)的需要,現(xiàn)有的種子一般是直接從野生環(huán)境中篩選出來(lái),最多進(jìn)行了初步的馴化改良,其農(nóng)藝性狀遠(yuǎn)不能滿足大規(guī)模養(yǎng)殖的需要，生產(chǎn)性栽培需要高密度,高光效,高含油量,高抗病,高抗蟲,對(duì)環(huán)境溫度、pH、鹽濃度的變化也要有較強(qiáng)的適應(yīng)性的品種,才能高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),提高產(chǎn)出。因此,培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的新品種是微藻產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

基因組改組技術(shù)是一種新的體內(nèi)分子育種方法,利用遞進(jìn)式遺傳重組模擬了微生物自然進(jìn)化過(guò)程,通過(guò)多親本之間的全基因組的融合重組,將優(yōu)良性狀組合在一起,能在短時(shí)間內(nèi)大幅度提高微生物細(xì)胞的表型,是近來(lái)極受關(guān)注的育種新技術(shù)。雖然基因組改組技術(shù)的育種效果顯著,并且已有一些成功應(yīng)用的實(shí)例[3-5],但利用基因組改組技術(shù)對(duì)微藻進(jìn)行定向改造,目前尚未見報(bào)道。本文利用基因組改組技術(shù)對(duì)富含油脂的日本小球藻進(jìn)行選育,進(jìn)一步提高其油脂產(chǎn)率,為小球藻油脂工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

日本小球藻(Chlorellahirataii) 購(gòu)自上海光語(yǔ)公司，將微藻按照10%的接種量培養(yǎng)于含250 mL的F/2培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)。人工氣候箱的培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度3500 lux,暗光周期為12 h/12 h,培養(yǎng)溫度為(24±1) ℃,每日搖動(dòng)3～4次;甲基磺酸乙酯(EMS)、半纖維素酶(0.3～3.0 U/mg),果膠酶(400～800 U/g) 美國(guó)Sigma公司;纖維素酶(≥0.3 U/mg) Solarbio公司;其他試劑 國(guó)產(chǎn)分析純;再生培養(yǎng)基:新鮮的F/2海水培養(yǎng)基中添加0.2 mol/L甘露醇,固體培養(yǎng)基另加0.8%～1.0%的瓊脂。

ZHJH-C1112B超凈工作臺(tái) 上海智誠(chéng)分析儀器公司;BG-01超聲水浴鍋 廣州邦活超聲波設(shè)備公司;HZ300L恒溫水浴鍋 武漢瑞華儀器設(shè)備公司;HPLC,Agilent 1100,Agilent;CX21FS1雙目生物顯微鏡 日本奧利巴斯;MICR017冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾公司;Bx51倒置熒光顯微鏡 奧林巴斯。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藻種的誘變 紫外誘變:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液6 mL(細(xì)胞密度約為7.8×106個(gè)/mL)置于9 cm培養(yǎng)皿底部鋪一薄層,在距離紫外燈光源40 cm距離下,用20 W的紫外燈照射21 min。誘變結(jié)束后,避光培養(yǎng)12 h后正常培養(yǎng)3 d。將藻液用新鮮培養(yǎng)基稀釋至10000個(gè)/mL藻細(xì)胞后涂布于培養(yǎng)基上,置于人工氣候箱中培養(yǎng)。

EMS誘變:取10 mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液,4000 r/min下離心10 min,收集藻細(xì)胞,加入0.6%的EMS溶液,懸浮至10 mL。30 min后加入1 mL 5%硫代硫酸鈉溶液終止誘變,離心去除誘變液,去離子水沖洗一次之后用新鮮培養(yǎng)液洗滌兩次,置于暗環(huán)境中培養(yǎng)12 h后用新鮮的培養(yǎng)基稀釋至10000個(gè)/mL藻細(xì)胞后涂布于培養(yǎng)基上,置于人工氣候箱中培養(yǎng)。

1.2.2 篩選方法 初篩:用正己烷將尼羅紅粉末配制成0.5 mg/mL的尼羅紅染色液,再用20%DMSO將尼羅紅母液稀釋為0.5 μg/mL,過(guò)濾除菌。待平板上長(zhǎng)出均勻的微藻藻落時(shí),用1 μg/L的尼羅紅噴染,暗培養(yǎng)24 h后在熒光顯微鏡下觀察藻類染色情況,挑取熒光強(qiáng)度大的單藻落接種到含有2 mL F/2培養(yǎng)基的玻璃試管中,擴(kuò)大培養(yǎng)。

復(fù)篩:將初步篩選結(jié)果中的產(chǎn)脂較好的微藻按照10%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)于含250 mL的培養(yǎng)基的500 mL三角錐形瓶中培養(yǎng),待到指數(shù)生長(zhǎng)末期采用8000 r/min,10 min離心收集微藻,-20 ℃預(yù)冷凍8 h,冷凍干燥10 h,采用Blight和Dyer[2]方法提取總脂肪酸。

1.2.3 原生質(zhì)體的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的日本小球藻8000 r/min離心10 min,用滅過(guò)菌的去離子水洗2～4次,以保證細(xì)胞表面無(wú)鹽離子和其他雜質(zhì)影響原生質(zhì)體的制備。用無(wú)菌PBS懸浮細(xì)胞并將藻細(xì)胞調(diào)整至2×107cells/mL。加入終濃度為2%的半纖維素酶,2%纖維素酶與2%果膠酶,對(duì)日本小球藻作用時(shí)間為8 h,離心后備用。

1.2.4 原生質(zhì)體再生與融合 原生質(zhì)體再生與融合以及再生率的計(jì)算參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.5 基因組改組 以突變株作為基因組改組的第一輪藻株,制備原生質(zhì)體并進(jìn)行原生質(zhì)體融合。融合后的藻液進(jìn)行稀釋后涂布于再生培養(yǎng)基平板上,待長(zhǎng)出藻落后進(jìn)行初篩和復(fù)篩,所得油脂含量提高的藻株作為下一輪基因組改組的親本。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 將篩選得到的改組藻株中連續(xù)轉(zhuǎn)接6代,比較第一代與第六代的總脂含量,觀察是否能夠穩(wěn)定遺傳。

1.2.7 油脂產(chǎn)量以及生物量的測(cè)定 將初步篩選結(jié)果中的產(chǎn)脂較好的微藻按照10%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)于含250 mL的培養(yǎng)基的500 mL三角錐形瓶中培養(yǎng),測(cè)定其OD680 nm值。其比生長(zhǎng)速率按照以下公式[7]進(jìn)行計(jì)算:

μ=ln(Nt/No)/(Tt-To)

式中，Nt：為穩(wěn)定期懸浮藻液OD值,No：為接種第2 d懸浮藻液OD值,Tt：為進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)間,To：為接種第2 d的時(shí)間,倍增時(shí)間:Dt=0.6931/μ。

對(duì)擬微綠球藻和日本小球藻篩選出來(lái)的高產(chǎn)GS藻株和原始藻株進(jìn)行培養(yǎng),在指數(shù)末期收集藻粉用冷凍裝置干燥。將脂肪酸進(jìn)行甲酯化處理,氣相色譜條件為參考[8]稍作改進(jìn):載氣為體積分?jǐn)?shù)為高純度氮?dú)?柱初溫72 ℃,保溫1 min,以30 ℃/min升溫速率升至150 ℃,保持5 min,以10 ℃/min升溫速率升至250 ℃,保溫5 min;進(jìn)樣口溫度280 ℃,流速為30 mL/min,進(jìn)樣量1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1候選藻庫(kù)的構(gòu)建

尼羅紅作為一種親脂類熒光染料,與脂類物質(zhì)結(jié)合后在熒光照射后能發(fā)出紅色或者橙色熒光。通過(guò)測(cè)定尼羅紅染色后的熒光強(qiáng)度能判斷其細(xì)胞中的油脂含量。將藻液進(jìn)行尼羅紅染色,觀察細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度及油脂數(shù)量、大小,從而篩選出優(yōu)勢(shì)藻株。

如圖1所示,根據(jù)分析結(jié)果,經(jīng)過(guò)紫外誘變和EMS誘變共篩選出9株正向突變的誘變?cè)逯?經(jīng)過(guò)遺傳穩(wěn)定性分析,UC38、EC09、EC24和EC74這4株日本小球藻突變株第一代與第六代的總脂變化含量不顯著(p>0.05),相較于出發(fā)藻株,分別提高了29.32%、26.16%、53.67%、34.01%。遺傳穩(wěn)定性良好。因此選擇UC38、EC09、EC24和EC74這4株藻株作為日本小球藻基因組改組的出發(fā)藻株。

圖1 日本小球藻高產(chǎn)誘變株遺傳穩(wěn)定性考察Fig.1 Genetic stability of the high-liquid mutants of Chlorella hirataii

2.2融合子篩選及遺傳穩(wěn)定性分析

以候選藻庫(kù)中的4株藻株為出發(fā)藻株,進(jìn)行第一輪改組。得到油脂含量進(jìn)一步提高的藻株:F1C1、F1C2、F1C3、F1C4、F1C5。五株融合株的總脂含量分別為53.02%、49.34%、51.33%、45.72%、50.00%。經(jīng)遺傳穩(wěn)定性檢測(cè),日本小球藻第一輪融合藻株F1C2、F1C4和F1C5的遺傳穩(wěn)定性良好,而F1C1和F1C5可能是異核子,在多次傳代過(guò)后會(huì)分離成親本類型,其優(yōu)良性狀也會(huì)消失(圖2)。

圖2 日本小球藻第一輪改組篩選結(jié)果Fig.2 Genetic stability of the first shuffled strains with high total liquids

以第一輪改組獲得的3株菌株為出發(fā)藻株進(jìn)行第二輪基因組改組,結(jié)果獲得6株總脂產(chǎn)量有所提高藻株F2C1、F2C2、F2C3、F2C4、F2C5和F2C6。

將日本小球藻的第二輪改組之后的藻株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng),在指數(shù)生長(zhǎng)期末期離心提取總脂肪含量,檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性。

由圖3可知,日本小球藻第二輪融合藻株F2C2的遺傳穩(wěn)定性良好,第一代與第六代的油脂含量無(wú)明顯差異(p>0.05)，其油脂最終含量達(dá)到59.01%，較原始菌株提高了101.4%;其他5株藻株性狀表現(xiàn)不夠穩(wěn)定,第一代與第六代的油脂含量差異顯著(p<0.05),多次傳代后,其優(yōu)良性狀逐漸喪失。

圖3 日本小球藻第二輪高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)藻株遺傳穩(wěn)定性分析Fig.3 Genetic stability of the second shuffled strains with high total liquids

2.3改組藻株和原始藻株的生長(zhǎng)特性以及生物量

由圖4可以看出,日本小球藻的改組藻株與出發(fā)藻株的生長(zhǎng)曲線基本相似。從這幾株微藻的生長(zhǎng)曲線可以看出,日本小球藻在接種后沒(méi)有適應(yīng)期。F2C2的生長(zhǎng)速率和出發(fā)藻株相差不大。在1～6 d出發(fā)藻株的生長(zhǎng)速率要大于改組藻株F2C2,在這之后F2C2的生長(zhǎng)速率就快于出發(fā)藻株。

圖4 日本小球藻改組和原始藻株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig.4 The Chlorella hirataii’s growth curve of GS strains

由圖5和圖6結(jié)果可以看出,全面地評(píng)價(jià)微藻藻株的產(chǎn)油潛力,不僅需要看總脂含量或生物量干重來(lái)判斷,同時(shí)需要引入單位體積總脂含量和單位體積總脂產(chǎn)率2個(gè)指標(biāo),通過(guò)綜合比較、分析,篩選出優(yōu)良的高產(chǎn)油微藻藻株。以藻液?jiǎn)挝惑w積總脂含量和總脂產(chǎn)率為評(píng)價(jià)指標(biāo),根據(jù)SPSS的分析結(jié)果得知,與出發(fā)藻株相比，改組藻株的單位體積總脂含量和單位體積總脂產(chǎn)率都有了顯著的提高(p<0.05)。

圖5 日本小球藻出發(fā)藻株與F2C2單位體積總脂產(chǎn)率Fig.5 The total fat yield per unit volume of the orginal Chlorella hirataii and F2C2

圖6 日本小球藻出發(fā)藻株和F2C2單位體積總脂含量Fig.6 Total fat content per unit volume of the orginal Chlorella hirataii and F2C2

2.4日本小球藻總脂含量的組分分析

由圖7可知，改組前后的日本小球藻氣相色譜圖的峰形以及出峰時(shí)間沒(méi)有變化,說(shuō)明改組前后的日本小球藻的總脂組成成分沒(méi)有變化。由于兩個(gè)氣相圖譜的峰值大小有差異,說(shuō)明改組藻株和初始藻株的總脂肪酸的組分含量有很大變化。

圖7 日本小球藻初始藻株(a) 與改組藻株F2C2(b)的氣相圖譜Fig.7 Gas chromatogram of the original Chlorella hirataii and F2C2

3 討論與結(jié)論

雖然經(jīng)典的隨機(jī)誘變、定向篩選的育種方法工作量大,周期長(zhǎng),隨機(jī)性強(qiáng),效率低,很難在短時(shí)間內(nèi)獲得高產(chǎn)量的正向突變株,但是依然是目前使用的主要育種手段。genome shuffling是在整個(gè)微生物基因組水平上進(jìn)行重排的技術(shù),經(jīng)過(guò)遞歸式多次融合,使基因組在較大范圍內(nèi)發(fā)生交換和重組,將引起正向突變的不同基因重組到一個(gè)細(xì)胞中。目前國(guó)內(nèi)外通過(guò)genome shuffling獲得高產(chǎn)油脂的藻株的選育還鮮有報(bào)道。利用基因組技術(shù)成功選育脂肪酶[9]、谷氨酸[10]和抗生素[11]高產(chǎn)菌株的報(bào)道證明,基因組改組技術(shù)是一種行之有效的育種方法。

進(jìn)行基因組改組首先需要構(gòu)建一個(gè)候選菌庫(kù),該菌庫(kù)中各正突變株的基因組之間差別越大,基因組改組后獲得表型有較大改進(jìn)的雜交菌種的可能性就越大[12]。本研究在紫外誘變和甲基磺酸乙酯誘變獲得幾種不同的正向突變株的基礎(chǔ)上,采用基因組改組技術(shù)將各正向突變體親本進(jìn)行雜交融合,篩選整合各正向突變的重組子代。改進(jìn)篩選方法,采用尼羅紅熒光染色法對(duì)微藻進(jìn)行初步產(chǎn)油鑒定,尼羅紅染色法可以直觀觀察細(xì)胞內(nèi)的油脂含量情況,相比氣相色譜操作更方便,操作時(shí)間更短,僅需簡(jiǎn)單染色即可,因此選擇尼羅紅染色法進(jìn)行初篩更高效。

日本小球藻的種內(nèi)融合會(huì)造成細(xì)胞大小產(chǎn)生變化,但是由于遺傳物質(zhì)以及代謝產(chǎn)物等內(nèi)容物基本一致,其細(xì)胞生理生化特性也不會(huì)發(fā)生很大變化。兩個(gè)原生質(zhì)體的融合產(chǎn)生的也不一定是融合子,也有可能是異核體。異核體并非真正的融合子,結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。隨著細(xì)胞分裂的發(fā)生,新的性狀也會(huì)漸漸消失變成親本特性[13]。所以為了得到性狀穩(wěn)定遺傳的融合子,需要對(duì)篩選出來(lái)的藻株進(jìn)行連續(xù)傳代來(lái)培養(yǎng)考察其優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性。本文中所得到的融合藻株的遺傳穩(wěn)定性均不高,可能在于微藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)相較于原核生物更為復(fù)雜,細(xì)胞融合較為困難。

經(jīng)過(guò)多輪融合篩選過(guò)后選育出了日本小球藻高產(chǎn)油脂藻株F2C2,其油脂最終含量達(dá)到59.01%,較原始藻株提高了101.4%。在實(shí)現(xiàn)規(guī)?；⒃迳a(chǎn)之前,還需要進(jìn)行大量的科研工作,如優(yōu)化藻株的生長(zhǎng)條件,對(duì)微藻進(jìn)行基因水平的定向分子改造。

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IncreasethelipidproductionofChlorellahirataiirapidlybygenomeshuffling

LIUHong-quan,YUANSha,LUEn-qiu,PANYi-hua,YANGHai-yan,LONGHan,XUANJin-cai,HEXiu-miao

(College of Ocean and Biotechnology,Guangxi University for Nationalities,Guangxi Key Laboratory Cultivation Base for Polysaccharide Materials and their Modification，Nanning 530007,China)

StrainChlorellahirataiiwas used as the starting strains for genome shuffling. They were mutated by UV-light and ethylmesylate separately,and four mutant strains with increased lipids yield were selected. Two rounds of genome shuffling were carried out with the four mutant strains using PEG to mediate protoplasts fusion. Finally,theChlorellahirataiiF2C2 was selected which produced lipids(59.01%)higher than the original strain by 101.4%. Compare with the original strain in the same batch,the total lipid composition of theChlorellahirataiiF2C2 didn’t change a lot,but there was a big gap between the content of each component.

genome shuffling;total lipid content;Chlorellahirataii

2017-04-11

劉紅全(1975-)，男，博士，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)方面的研究，E-mail:lhongquan@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(30960215)；廣西自然科學(xué)基金(桂科青0728019)；廣西民族大學(xué)相思湖青年學(xué)者創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目。

TS201.3

A

1002-0306(2017)21-0096-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.020