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猴頭菇醇提物及其不同極性部位的 體外抗氧化活性

2017-11-21 10:28:47惠華
食品工業(yè)科技 2017年21期
關鍵詞:猴頭菇提物石油醚

,,,惠華,*

(1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640; 2.廣東太陽神集團有限公司,廣東廣州 510665)

猴頭菇醇提物及其不同極性部位的 體外抗氧化活性

黃越1,周春暉2,戴宏杰1,黃惠華1,*

(1.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640; 2.廣東太陽神集團有限公司,廣東廣州 510665)

以猴頭菇為原材料,探究猴頭菇醇提物及其不同極性萃取相的體外抗氧化活性。采用不同極性有機溶劑萃取猴頭菇醇提物得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相4個不同極性部位萃取物。分別測定各極性部位總酚和總黃酮含量,并比較猴頭菇醇提物及其各極性部位的體外抗氧化活性。結果表明:乙酸乙酯相的總酚和總黃酮含量最高,分別為16.52 mg/g和10.08 mg/g。猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取物均具有一定的抗氧化活性,其中乙酸乙酯相的抗氧化活性相對較高,對DPPH·、·OH和ABTS+·的清除率分別可達到41.64%(2.5 mg/mL)、82.84%(2.5 mg/mL)和89.18%(0.5 mg/mL)。由此可見,猴頭菇醇提物的乙酸乙酯相萃取組分具有較好的抗氧化活性,可作為主要活性部位進行后續(xù)單體分離研究。

猴頭菇,醇提物,極性部位,抗氧化活性

猴頭菇(Hericiumerinaceus)屬擔子菌綱、多孔菌目、齒菌科、猴頭屬,又名猴頭、猴頭菌、猴頭蘑、刺猬菌等,是我國著名的食藥兼用菌,其營養(yǎng)豐富,味道鮮美,素有“山珍猴頭,海味燕窩”之稱[1]。猴頭菇中含有多糖、低聚糖、多肽、猴頭菌素、猴頭菌酮、甾醇類、脂肪酸和腺苷等多種活性物質,具有抗氧化[2]、降血糖[3]、降血脂[4]、抑菌[5]、抗腫瘤[6]、增強機體免疫力[7]等多種生物活性。

目前關于猴頭菇功效成分的研究仍以多糖為主,對其它小分子物質如多酚、黃酮的研究還遠遠不足。本課題組曾對猴頭菇多糖的抗氧化活性進行了相關研究,得到的水提猴頭菇粗多糖對DPPH·、·OH和ABTS+·的清除率分別可達到47.91%(5.0 mg/mL)、54.30%(5.0 mg/mL)和87.30%(0.5 mg/mL),說明猴頭菇資源具有良好的抗氧化活性潛力[8]。而在提取猴頭菇多糖時,通常會采用乙醇溶液浸泡一段時間進行預處理(主要目的為脫脂),浸泡后的殘渣再進行多糖提取,而乙醇浸泡液(醇提物)往往疏于研究和利用,造成了資源浪費,而相關研究表明,天然產(chǎn)物的乙醇提取物大都具有良好的生物活性[9-10]。Liu等[1]通過HPD-100大孔樹脂將猴頭菇子實體醇提物進行富集濃縮,再將提取物用石油醚和氯仿萃取,硅膠柱層析分離后得到兩種化合物,均具有顯著的抗幽門螺桿菌活性。杜秀菊等[11]采用系統(tǒng)溶劑法分離樺褐孔菌菌核的乙醇提取物,分別得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和乙醇相等4個不同極性部位,均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。其中乙醇相在其濃度為500 μg/mL時,對DPPH·和·OH的清除率可分別達到83.13%和52.44%。

本文以猴頭菇子實體為原料,采用低濃度乙醇溶液(50%)浸提得到猴頭菇醇提物,依次采用不同極性強度的有機溶劑(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇)進行梯度萃取,得到不同極性萃取組分和剩余水相組分。以還原能力和清除DPPH·、·OH、ABTS+·的能力為指標,篩選出具有較高抗氧化活性組分,為后續(xù)分離單體化合物提供依據(jù),豐富和提高了猴頭菇在食品、醫(yī)藥和保健領域的利用途徑和價值。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

猴頭菇子實體 產(chǎn)自吉林省長白山二道白河;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl,DPPH)、2,2′-氨基-雙(3-乙基苯并噻唑膠-6-磺酸)(2,2′-azino-bis(3-ethylbmzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑、蘆丁、鄰二氮菲、抗壞血酸(VC) 均購自美國Sigma公司;沒食子酸、硝酸鋁、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等 均為分析純。

HK-08B型流水式中藥粉碎機 廣州市旭朗機械設備有限公司;TDL-5-A型低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;UV-1800型紫外分光光度計 日本島津公司;RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;LGJ-10型冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2猴頭菇醇提物及其不同極性部位樣品的制備

[9]的方法并稍作改動,按圖1所述流程圖制備猴頭菇醇提物及其不同極性萃取組分和剩余水相組分樣品。具體制備方法如下:

選取新鮮的猴頭菇子實體為原料,切分成小塊后于50 ℃條件下干燥16 h,然后用中藥粉碎機進行粉碎,80目篩分,得猴頭菇干粉,繼續(xù)在50 ℃下干燥至恒重后備用。稱取一定量的猴頭菇干粉,按照料液比1∶15 g/mL與50%乙醇溶液進行混合,50 ℃水浴環(huán)境下提取5 h,所得提取液于3000 r/min離心10 min,收集上清液,剩余殘渣再按上述條件提取1次,合并2次上清液,45 ℃下旋蒸濃縮得乙醇提取浸膏,取部分浸膏冷凍干燥,得到猴頭菇乙醇提取物。將剩余醇提浸膏與一定量的蒸餾水混合,得到水懸浮液,按1∶1體積比依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取,每相萃取3次,得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相以及剩余部分水相萃取液。收集各相萃取液旋轉蒸發(fā)除去溶劑,冷凍干燥后得到猴頭菇醇提物的不同極性部位萃取物:石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相,置于-20 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 猴頭菇醇提物及其不同極性部位制備流程圖Fig.1 The preparation flow chart of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus

1.3總酚和總黃酮含量的測定

總酚含量的測定參考趙曉娟等[12]的方法,以沒食子酸為標準品,采用Folin-Ciocalteu法進行測定。精密稱取沒食子酸標準品10 mg,蒸餾水溶解定容至100 mL。分別吸取沒食子酸標準品溶液0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL于25 mL比色管中,依次加入5 mL蒸餾水和2.5 mL福林酚試劑,混勻靜置30 s后加入4 mL 12% Na2CO3溶液,蒸餾水定容至25 mL,45 ℃下避光反應1.5 h,將反應溶液于756 nm波長處測定吸光度。以沒食子酸標準品質量濃度C(μg/mL)為橫坐標,吸光值A為縱坐標,繪制總酚含量測定的標準曲線。

總黃酮含量的測定參考林建原等[13]的方法。以蘆丁為標準品,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法進行測定。精密稱取蘆丁標準品50 mg,50%乙醇溶解后定容至100 mL。分別吸取蘆丁標準品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL比色管中,加入5% NaNO2溶液0.3 mL,混勻后靜置6 min,然后加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,混勻靜置6 min,再分別加入4% NaOH溶液4.0 mL,補充50%乙醇溶液至10 mL,混勻后繼續(xù)靜置15 min,將反應溶液于510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁標準品質量濃度C(μg/mL)為橫坐標,吸光值A為縱坐標,繪制總黃酮含量測定的標準曲線。

1.4猴頭菇醇提物及其不同極性部位體外抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH·清除能力測定 參考Hua等[14]的方法并稍作修改。取1.0 mL不同質量濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的樣品溶液,加入無水乙醇配制的0.1 mmoL/L DPPH溶液3.0 mL,振蕩混勻后于室溫避光條件下反應30 min,517 nm波長處測定吸光度。以VC作為陽性對照,按式(1)計算DPPH·清除率:

式(1)

式中:Ax為加入1.0 mL樣品溶液和3.0 mL DPPH溶液后的吸光度;Ax0為1.0 mL樣品溶液和3.0 mL無水乙醇的吸光度;A0為1.0 mL蒸餾水和3.0 mL DPPH溶液的吸光度。

1.4.2 ·OH清除能力測定 參考Mao等[15]的方法并稍作修改。取1.0 mL不同質量濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的樣品溶液,加入0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL和0.15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)2.0 mL混合均勻,繼續(xù)加入0.75 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL,最后加入0.01% H2O2溶液1.0 mL并振蕩混勻,37 ℃水浴反應1.0 h,反應溶液于536 nm波長處測定吸光度。以VC作為陽性對照,按式(2)計算·OH清除率:

式(2)

式中:A1為加入樣品及H2O2時測得的吸光度;A0為以蒸餾水代替樣品時測得的吸光度;A2為以蒸餾水代替樣品及H2O2時測得的吸光度。

1.4.3 ABTS+·清除能力測定 參考Li等[16]的方法并稍作修改。將7 mmol/L ABTS+·溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等量混合反應,在室溫、避光條件下靜置12~16 h得到ABTS+·儲備液。使用時采用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH7.4)稀釋ABTS+·儲備液,至其在734 nm波長處的吸光度達到0.70±0.02,得到ABTS+·測定液。取1.0 mL不同質量濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的樣品溶液與2.0 mL ABTS+·測定液混合均勻,室溫避光放置6 min后測定其在734 nm波長處的吸光度。以VC作為陽性對照,按式(3)計算ABTS+·清除率:

式(3)

式中:Ai為加入樣品溶液和ABTS+·測定液后的吸光度;Aj為樣品溶液與磷酸鹽緩沖液的吸光度;A0為蒸餾水與ABTS+·測定液的吸光度。

1.4.4 還原力測定 參考Liu等[17]的方法并稍作修改。取2.0 mL不同質量濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的樣品溶液,加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)2.0 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.0 mL混合均勻,于50 ℃水浴保溫20 min,加入10%三氯乙酸溶液2.0 mL,振蕩混勻后離心(3000 r/min,5 min),然后取2.0 mL離心后上清液,與2.0 mL蒸餾水、0.4 mL 0.1% FeCl3溶液混合均勻,置于50 ℃水浴10 min后于700 nm波長處測定吸光度??瞻讓φ找哉麴s水代替樣品溶液,以VC作為陽性對照。

1.5數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1總酚和總黃酮含量測定標準曲線

采用Folin-Ciocalteu法測定的沒食子酸標準曲線方程為:Y=0.1277X+0.0377,回歸系數(shù)R2=0.9923,線性關系良好。其中X為測試溶液中的沒食子酸含量(μg/mL),Y為反應溶液在756 nm波長處的吸光值。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法測定的蘆丁標準曲線方程為:Y=0.0127X+0.0135,回歸系數(shù)R2=0.9990,線性關系良好。其中X為測試溶液中的蘆丁含量(μg/mL),Y為反應溶液在510 nm波長處的吸光值。

2.2猴頭菇醇提物及其不同極性部位得率、總酚及總黃酮含量

表1 猴頭菇醇提物及其不同極性部位得率、 總酚及總黃酮含量Table 1 The yield and the contents of total phenols and flavonoids of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus(±SD,n=3)

注:同列標記字母不同,表示差異顯著,p<0.05。醇提物得率(%)=(醇提物干重/原料干重)×100;各極性部位得率(%)=(各極性部位干重/醇提物干重)×100。

多酚和黃酮類物質在自然界分布廣泛,且大多具有非常強的抗氧化活性[18]。由于不同種類的多酚和黃酮類物質的溶解性質不同,采用不同的有機溶劑萃取得到的萃取物中所含多酚與黃酮的種類和數(shù)量也會有所差異[19]。猴頭菇醇提物及其不同極性部位得率、總酚及總黃酮含量測定結果見表1。其中,猴頭菇醇提物得率為41.35%。采用不同極性溶劑萃取后得到的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和剩余水相組分的得率分別為3.23%、2.55%、7.99%和42.25%。猴頭菇醇提物及其不同極性萃取相均含有一定量的多酚和黃酮,其中總酚含量從高到低依次為:乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相>醇提物>水相,這與吳峰華等[10]對覆盆子醇提物及其不同極性部位的總酚含量研究一致??傸S酮含量從高到低依次為:乙酸乙酯相>醇提物>石油醚相>水相>正丁醇相。由此可知,乙酸乙酯相中總酚與總黃酮含量均高于醇提物及其他萃取相,這與國旭丹等[20]對苦蕎麩乙醇粗提物及其各極性部位的總酚與總黃酮含量測定結果一致。綜上說明,猴頭菇醇提物乙酸乙酯萃取相和其它萃取相相比含有較高含量的黃酮和多酚類物質,含量分別達到16.52 mg/g和10.08 mg/g,推測其可能具有更高的抗氧化活性。

2.3猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取相的體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH·清除能力 由圖2可知,猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取組分均表現(xiàn)出一定的DPPH·清除能力。在質量濃度0.5~2.5 mg/mL范圍內,所有樣品對DPPH·的清除能力均隨樣品濃度的升高而逐漸增大,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。猴頭菇醇提物及其不同極性萃取相對DPPH·的清除率大小依次為:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相,其中乙酸乙酯相對DPPH·的清除率明顯高于其他萃取相,正丁醇相對DPPH·的清除效果與水相相當,但均高于石油醚相,這與徐海燕等[21]對新疆紫草不同極性萃取部位對DPPH·清除能力的研究結果一致。當樣品濃度為2.5 mg/mL時,猴頭菇醇提物、石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相對DPPH·的清除率分別達到21.96%、21.88%、41.64%、33.37%和32.74%,萃取組分中乙酸乙酯相對DPPH·的清除效果最佳,這可能與其含有更高含量的多酚和黃酮類物質有關。而猴頭菇水提粗多糖在濃度3.0 mg/mL時對DPPH·的清除率為40.5%,低于乙酸乙酯相萃取組分[8],說明猴頭菇醇提物及其萃取物的利用具有一定價值。吳峰華等[10]對覆盆子醇提物及其不同極性部位中的總酚和黃酮含量與抗氧化能力間的相關性進行研究,結果表明總酚含量與抗氧化活性呈正相關性。栗銘鴻等[22]對元蘑醇提物不同極性部位清除自由基活性進行研究,當樣品濃度為5 mg/mL時,元蘑醇提物的乙酸乙酯萃取部位對DPPH·清除率僅為30%。

圖2 猴頭菇醇提物及其不同極性萃取相對DPPH·的清除率Fig.2 Scavenging rate of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus on DPPH·注:圖中各個小圖是VC的清除率;圖3~圖5同。

2.3.2 ·OH清除能力 由圖3可知,猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取相均表現(xiàn)出一定的清除·OH能力。在質量濃度0.5~2.5 mg/mL范圍內,所有樣品對·OH的清除能力均隨樣品濃度的增加而逐漸增大,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。猴頭菇醇提物及其不同極性萃取相對·OH的清除率大小依次為:石油醚相>乙酸乙酯相>水相>正丁醇相>醇提物。石油醚相和乙酸乙酯相對·OH的清除效果顯著高于猴頭菇醇提物、正丁醇相和水相的清除效果,表現(xiàn)出較強的清除·OH活性,這與薛雅榮等[9]對菠蘿皮渣醇提物不同極性部位清除·OH能力的研究結果一致。當樣品濃度為2.5 mg/mL時,石油醚相和乙酸乙酯相對·OH的清除率分別達到96.85%和82.84%,顯著高于猴頭菇醇提物(41.73%)、正丁醇相(43.74%)和水相(48.35%),這可能與石油醚相和乙酸乙酯相含有更高含量的黃酮和多酚有關。而猴頭菇水提粗多糖在濃度3.0 mg/mL時對·OH的清除率為31.96%[8],遠低于醇提物及其各相萃取組分。

圖3 猴頭菇醇提物及其不同極性萃取相對·OH的清除率Fig.3 Scavenging rate of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus on ·OH

2.3.3 ABTS+·清除能力 如圖4所示,猴頭菇醇提物及其不同極性萃取相均具有一定的清除ABTS+·能力。在質量濃度0.1~0.5 mg/mL范圍內,所有樣品對ABTS+·的清除能力均隨樣品濃度的升高而逐漸增大,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。猴頭菇醇提物及其不同極性萃取相對ABTS+·的清除率大小依次為:乙酸乙酯相>正丁醇相>醇提物>水相>石油醚相。在測試濃度范圍內,乙酸乙酯相和正丁醇相對ABTS+·的清除率明顯高于其它樣品,表現(xiàn)出相對較強的清除ABTS+·活性。當樣品濃度達到0.3 mg/mL后,繼續(xù)增加樣品濃度,乙酸乙酯相和正丁醇相對ABTS+·的清除率增加緩慢,基本保持平衡,清除率分別達到88.12%和85.47%,高于同濃度下猴頭菇醇提物(65.27%)、石油醚相(47.64%)、水相(64.11%)以及猴頭菇水提粗多糖(78.08%)[8]的清除ABTS+·活性。

圖4 猴頭菇醇提物及其不同 極性萃取相對ABTS+·的清除率Fig.4 Scavenging rate of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus on ABTS+·

2.3.4 還原能力 由圖5可知,猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取相均具有一定的還原能力。在質量濃度0.5~2.5 mg/mL范圍內,所有樣品的還原能力均隨樣品濃度的升高而逐漸增大,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。其中,乙酸乙酯相的還原能力顯著高于其他相,而其他相的還原能力相差不大,但是均低于VC的還原能力,這與上述實驗分析中乙酸乙酯相比其它相組分具有更好DPPH·、·OH和ABTS+·清除活性結果一致。國旭丹等[20]對苦蕎麩乙醇粗提物各極性成分的還原能力測定結果也呈現(xiàn)出相同的趨勢。當樣品濃度為2.5 mg/mL時,乙酸乙酯相在700 nm波長處的吸光值達到0.897,顯著高于猴頭菇醇提物(0.531)、石油醚相(0.535)、正丁醇相(0.521)和水相(0.505)。而猴頭菇水提粗多糖在濃度為3.0 mg/mL時的吸光值為0.78[8],因此其還原能力低于乙酸乙酯相。

圖5 猴頭菇醇提物及其不同極性萃取相的還原能力Fig.5 Reducing power of ethanol extract and its different polar fractions from Hericium erinaceus

3 結論

猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取相的總酚和總黃酮含量及其體外抗氧化活性均存在一定差異。其中乙酸乙酯相的總酚和總黃酮含量最高,分別為16.52 mg/g和10.08 mg/g。猴頭菇醇提物及其不同極性部位萃取相均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性,且在一定濃度范圍內呈現(xiàn)明顯的量效關系。在相同濃度下,乙酸乙酯相的抗氧化活性相對較高,對DPPH·、·OH和ABTS+·的清除率分別可達到41.64%(2.5 mg/mL)、82.84%(2.5 mg/mL)和89.18%(0.5 mg/mL),但對·OH的清除率稍低于石油醚相(96.85%)。綜上分析表明猴頭菇醇提物中乙酸乙酯相萃取組分具有較好的綜合抗氧化活性,可作為目標活性部位進行后續(xù)分離單體化合物研究,為猴頭菇在醫(yī)藥、保健品和功能食品中的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

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InvitroantioxidantactivityofethanolextractfromHericiumerinaceusanditsdifferentpolarfractions

HUANGYue1,ZHOUChun-hui2,DAIHong-jie1,HUANGHui-hua1,*

(1.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.Guangdong Apollo Croup. Co.,Ltd.,Guangzhou 510665,China)

The antioxidant activitiesinvitroof ethanol extract fromHericiumerinaceusand its different polar fractions were studied and compared. The obtained ethanol extract fromHericiumerinaceuswas fractionated by different inorganic solvents orderly,including petroleum ether,ethyl acetate,n-butanol and water. The contents of total phenols and flavonoids of different polar fractions and their antioxidant activities were determined and compared. The results indicated that the ethyl acetate fraction showed the highest contents of total polyphenols and flavonoids(16.52 mg/g and 10.08 mg/g,respectively). The different polar fractions showed certain antioxidant activities,especially the ethyl acetate fraction whose scavenging rate on DPPH·,·OH and ABTS+· was 41.64%(2.5 mg/mL),82.84%(2.5 mg/mL)and 89.18%(0.5 mg/mL)respectively. These results demonstrated that ethyl acetate fraction had the highest antioxidant activity and can be employed as effective fractions for further investigation on antioxidants.

Hericiumerinaceus;ethanol extract;polar fractions;antioxidant activity

2017-04-18

黃越(1994-),女,碩士研究生,研究方向:農產(chǎn)品深加工,E-mail:huangyuecn@163.com。

*

黃惠華(1959-),男,博士,教授,研究方向:農產(chǎn)品加工與貯藏,E-mail:fehhuang@scut.edu.cn。

廣東省科技計劃項目(2013B090600008)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)21-0016-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.004

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