田 薇，章建國，劉益飛，卞兆連，黃 華，靳 欽

胃癌組織中LRG1與E-cadherin的表達(dá)及臨床意義

田 薇1，章建國1，劉益飛1，卞兆連2，黃 華1，靳 欽1

目的探討胃癌中富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1(leucine-rich α2 glycoprotein 1, LRG1)的表達(dá)及臨床意義。方法采用免疫組化法檢測(cè)74例胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中LRG1、E-cadherin的表達(dá)；探討胃癌組織及癌旁組織中LRG1、E-cadherin的表達(dá)，并分析LRG1表達(dá)與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性及與臨床病理特征、患者生存時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果LRG1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.01)，E-cadherin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(P<0.01)，LRG1表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，胃癌中LRG1的表達(dá)與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期等無關(guān)(P>0.05)。Kaplan-Meier單因素統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示LRG1高表達(dá)組患者術(shù)后生存時(shí)間明顯低于LRG1低表達(dá)組(P<0.05)。結(jié)論LRG1在胃癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，其高表達(dá)抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移，且有助于判斷腫瘤的惡性生物學(xué)行為及預(yù)后評(píng)估。

胃腫瘤；LRG1；E-cadherin；預(yù)后

胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康，是我國常見高發(fā)腫瘤之一，其病程進(jìn)展快，患者預(yù)后差，病死率位居惡性腫瘤的第2位[1]。目前人類對(duì)于胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制缺乏深入了解，晚期胃癌患者生存期短，生存質(zhì)量差，因此如能早期發(fā)現(xiàn)并診斷胃癌，將有助于患者獲得相對(duì)較長的生存期，這需要篩選出新的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，從而有效的診斷和治療。富含亮氨酸的α-2-糖蛋白(leucine-rich α2 glycoprotein 1, LRG1)于1977年從人類血清中第一次分離出來，研究發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤組織中LRG1高表達(dá)，如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢上皮性癌等[2-3]?，F(xiàn)已證明，LRG1在某些腫瘤的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞存活及遷移中發(fā)揮作用[4]。E-cadherin與細(xì)胞黏附有關(guān)，近年來，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epitheial-mesenchymaltransition, EMT)在炎癥性疾病[5]及在惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移中的作用備受關(guān)注，EMT常表現(xiàn)為E-cadherin的表達(dá)丟失。目前尚未有研究對(duì)胃癌中LRG1基因的表達(dá)進(jìn)行描述，本實(shí)驗(yàn)通過觀察LRG1、E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，及LRG1與臨床病理特征的關(guān)系，探討LRG1、E-cadherin在胃癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲中的意義及預(yù)后評(píng)估。

1 材料與方法

1.1材料收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院2012年6月～2013年12月手術(shù)切除的74例胃癌標(biāo)本，均有完整的臨床及隨訪資料。其中男性63例，女性11例，年齡38～88歲，平均62.0歲。所有病例系原發(fā)，術(shù)前均未接受放、化療。另選距腫瘤5 cm的相應(yīng)癌旁組織作為對(duì)照。

1.2試劑鼠抗人LRG1單克隆抗體購自Abcam公司(抗體稀釋濃度1 ∶100)，鼠抗人E-cadherin單克隆抗體及免疫組化試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3免疫組化標(biāo)本均用10%中性福爾馬林固定24 h，常規(guī)石蠟包埋， 4 μm厚切片，貼附于預(yù)先用1%多聚賴氨酸處理的載玻片65 ℃烤片1.5 h，采用EnVision法檢測(cè)，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，以已知陽性肺癌組織切片作為陽性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷LRG1定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性結(jié)果呈棕黃色或棕褐色顆粒；E-cadherin定位于細(xì)胞膜，陽性結(jié)果呈棕黃色或棕褐色顆粒，根據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度和范圍分為：未見陽性細(xì)胞為陰性(-)；陽性細(xì)胞未超過半數(shù)且染色較淺為陽性(+)/低表達(dá)；陽性細(xì)胞超過半數(shù)且染色較深為強(qiáng)陽性()/高表達(dá)。

1.5隨訪采用電話方式進(jìn)行隨訪。隨訪時(shí)間1～48個(gè)月，生存49例，死亡25例?？偵嫫?overall survival, OS)為自手術(shù)日期至死亡或隨訪結(jié)束日期。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用GraphPad Prism 5.0及SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)臨床病理資料及表達(dá)的差異性采用χ2檢驗(yàn)，對(duì)生存數(shù)據(jù)采用Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，應(yīng)用Log-rank法檢驗(yàn)差異性。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1LRG1在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)LRG1的免疫組化染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核也有著色(圖1)，其在胃癌組織及癌旁組織中的陽性率分別為82.43%(61/74)、56.76%(42/74)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

ABCD

圖1LRG1在癌旁及胃癌組織中的表達(dá)：A.LRG1在癌旁胃黏膜中的表達(dá)；B.LRG1在高分化胃癌中的表達(dá)；C.LRG1在中分化胃癌中的表達(dá)；D.LRG1在低分化胃癌中的表達(dá)，EnVision法

圖2 胃癌及癌旁組織中LRG1的表達(dá)

2.1E-cadherin在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)E-cadherin的免疫組化染色主要定位于細(xì)胞膜(圖3)，其在胃癌及癌旁組織中的陽性率分別為77.03%(57/74)、94.59%(70/74)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4)。

2.2LRG1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，LRG1表達(dá)與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期以及神經(jīng)侵犯無關(guān)(P>0.05，表1)。

2.3胃癌組織中LRG1高表達(dá)和低表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系LRG1高表達(dá)組的患者術(shù)后生存時(shí)間明顯低于LRG1低表達(dá)組(P<0.05，圖5)。

ABCD

圖3E-cadherin在癌旁組織及胃癌組織中的表達(dá)：A.E-cadherin在癌旁胃黏膜中的表達(dá)；B.E-cadherin在高分化胃癌中的表達(dá)；C.E-cadherin在中分化胃癌中的表達(dá)；D.E-cadherin在低分化胃癌中的表達(dá)，EnVision法

表1 LRG1表達(dá)與胃癌病理特征的關(guān)系

圖4 胃癌及癌旁組織中E-cadherin的表達(dá)

圖5 LRG1高表達(dá)組和低表達(dá)組胃癌患者的生存率

2.4胃癌組織中LRG1與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性胃癌組織中LRG1與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，LRG1蛋白高表達(dá)時(shí)，E-cadherin蛋白呈低表達(dá)(r=-0.334，P<0.05)。

3 討論

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，由于人們飲食習(xí)慣的改變，我國胃癌患者的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)。胃癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多因素、多步驟的過程。早期胃癌多無癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)常為中晚期，患者預(yù)后差。因此探討胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有助于胃癌的治療，以期延長患者的生存期。

LRG由Haupt和Baudner于1977年第一次從人類血清中提取分離出來，包含312個(gè)氨基酸殘基，其中66個(gè)為亮氨酸。LRG包括8個(gè)共有序列，每個(gè)序列含有24個(gè)氨基酸殘基，稱為富含亮氨酸重復(fù)序列[6]。LRG1是富含亮氨酸重復(fù)序列家族成員之一，研究顯示其是一種抗凋亡因子，在多種腫瘤組織及血清中表達(dá)上調(diào)，如肺非小細(xì)胞癌、卵巢癌、星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤等[2-3]。最新研究顯示，在結(jié)腸癌中LRG1表達(dá)明顯高于癌旁組織[7]，還有研究組證實(shí)相較于結(jié)腸發(fā)生的腺瘤性息肉，其表達(dá)也增高[8]，這些研究提示LRG1參與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LRG1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常胃組織(P<0.05)，LRG1表達(dá)與腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，提示LRG1的高表達(dá)促進(jìn)了胃癌腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲性生物學(xué)行為，LRG1表達(dá)異常與胃癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲有關(guān)。

研究顯示，在與敲除LRG1基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株相比，未經(jīng)敲除LRG1基因的細(xì)胞其遷移和浸潤能力明顯增強(qiáng)[7]；同時(shí)LRG1參與TGF-β信號(hào)途徑促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和血管發(fā)生[9]。TGF-β信號(hào)已被證實(shí)在體外誘導(dǎo)EMT。EMT是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要步驟，腫瘤細(xì)胞由于分子學(xué)改變導(dǎo)致功能異常，細(xì)胞與細(xì)胞間的粘連逐漸喪失，導(dǎo)致細(xì)胞失去極性，在EMT的過程中，上皮細(xì)胞逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基膜向周圍正常組織浸潤。E-cadherin是阻滯EMT發(fā)生的主要分子之一，LRG1是TGF-β的上游調(diào)節(jié)因子，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在胃癌組織中LRG1與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，低分化胃癌組織中LRG1高表達(dá)，而E-cadherin表達(dá)缺失，作者推測(cè)LRG1通過TGF-β信號(hào)通路下調(diào)E-cadherin，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促進(jìn)胃癌細(xì)胞浸潤性生長。關(guān)于其機(jī)制，研究認(rèn)為TGF-β1通過Smad介導(dǎo)Snail和Slug的表達(dá)，而這兩者是抑制E-cadherin基因的重要轉(zhuǎn)錄因子[10]。也有研究認(rèn)為TGF-β通過Notch1和其配體Jaggedl的介導(dǎo)促進(jìn)Slug的表達(dá)，從而減少E-cadherin的表達(dá)，加速EMT的發(fā)生進(jìn)程[11]。

綜上所述，胃癌中LRG1的表達(dá)上調(diào)與E-cadherin表達(dá)降低預(yù)示著胃癌發(fā)生、發(fā)展中存在EMT現(xiàn)象，LRG1通過TGF-β信號(hào)通路對(duì)E-cadherin起著調(diào)控作用，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LRG1高表達(dá)組患者生存率低于低表達(dá)組，因此LRG1與E-cadherin在評(píng)估胃癌患者的預(yù)后中有重要意義，也是胃癌潛在的靶向治療分子。LRG1和E-cadherin在胃癌演進(jìn)過程中的作用機(jī)制及相關(guān)信號(hào)分子通路有待進(jìn)一步深入探討。

[1] Chen W, Zheng R, Baade P D,etal. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[2] Nakajima M, Miyajima M, Ogino I,etal. Leucine-rich α-2-glycoprotein is a marker for idiopathic normal pressure hydrocephalus[J]. Acta Neurochirurgica, 2011,153(6):1339-1346.

[3] Zhong D, He G, Zhao S,etal. LRG1 modulates invasion and migration of glioma cell lines through TGF-β signaling pathway[J]. Acta Histochemica, 2015,117(6):551-558.

[4] Kakisaka T, Kondo T, Okano T,etal. Plasma proteomics of pan-creatic cancer patients by multi-dimensional liquid chromatography and two-dimensional difference gel electrophoresis ( 2D-DIGE) :up-regulation of leucine-rich alpha-2-glycoprotein in pancreatic cancer[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007,852(1-2):257-267.

[5] 徐 倩, 段 華, 汪 沙, 等. 宮腔粘連子宮內(nèi)膜組織中ArhGAP29、E-Cadherin的表達(dá)及意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2017,33(1):4-7.

[6] Bai X Y, Jin P. Expressions of serum LRG1 and CA125 in patients with epithelial ovarian cancer and their clinical significance[J]. Prog Obstet Gynecol, 2013,22(2):111-114.

[7] Zhang J, Zhu L, Fang J,etal. LRG1 modulates epithelial-mesenchymal transition and angiogenesis in colorectal cancer via HIF-1α activation[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016,35(1):29.

[8] Choi J W, Liu H, Shin D H,etal. Proteomic and cytokine plasma biomarkers for predicting progression from colorectal adenoma to carcinoma in human patients[J]. Proteomics, 2013,13(15):2361-2374.

[9] 劉兆國, 范方田, 趙林鋼, 等. 腫瘤血管生成新靶點(diǎn)LRG1研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2014,30(1):6-9.

[10] Siegel P M, Massagué J. Cytostatic and apoptotic actions of TGF-beta in homeostasis and cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2003,3(11):807-821.

[11] Leong K G, Niessen K, Kulic I,etal. Jagged1-mediated Notch activation induces epithelial-to-mesenchymal transition through Slug-induced repression of E-cadherin[J]. J Exp Med, 2007,204(12):2935-2948.

R 735.2

A

1001-7399(2017)10-1129-04

時(shí)間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.016.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.016

接受日期：2017-04-29

江蘇省衛(wèi)生廳面上項(xiàng)目(H201626)

1南通大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，南通 226000

2南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院南通市肝病研究所，南通 226000

田 薇，女，碩士，主治醫(yī)師。E-mail: tianweiw@163.com

劉益飛，男，博士研究生，通訊作者。E-mail: bluefiime@qq.com