曹 鐘，魏建國，岑紅兵，劉立紅，?；鄯?，敖啟林

·短篇論著·

胰腺實(shí)性-假乳頭狀腫瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中Claudin5和Claudin7的表達(dá)及意義

曹 鐘1，魏建國2，岑紅兵1，劉立紅3，?；鄯?，敖啟林5

目的探討Claudin5和Claudin7在胰腺實(shí)性-假乳頭狀腫瘤(solid-pseudopapillary neoplasm, SPN)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumor, NET)中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組化EnVision法檢測20例SPN和23例NET中β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR、Claudin5和Claudin7的表達(dá)。結(jié)果(1)在SPN和NET中β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR呈不同程度陽性表達(dá)。其中，β-catenin和CD10在SPN和NET中的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，β-catenin診斷SPN的敏感性為90.0%，特異性為52.2%；CD10診斷SPN的敏感性為80.0%，特異性為69.6%。其余6種標(biāo)志物差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(2)Claudin5在SPN中的陽性率為100%(20/20)，明顯高于NET(13.0%，3/23)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其診斷SPN的特異性(100%)和敏感性(87.0%)均高于β-catenin和CD10。(3)Claudin7在胰腺NET中的陽性率為100%(23/23)，而在所有SPN中均不表達(dá)；其診斷NET的特異性和敏感性均為100%。結(jié)論Claudin5和Claudin7分別在SPN和NET中呈腫瘤細(xì)胞胞膜陽性表達(dá)模式，是兩者的免疫組化特征。聯(lián)合檢測Claudin5、β-catenin、CD10和Claudin7有助于診斷和鑒別診斷SPN和NET。

胰腺腫瘤；實(shí)性-假乳頭狀腫瘤；神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤；Claudin5；Claudin7

胰腺實(shí)性-假乳頭狀腫瘤(solid-pseudopapillary neoplasm, SPN)較少見，其發(fā)病率占所有胰腺腫瘤的2%～3%，9%～15%患者可能發(fā)生轉(zhuǎn)移和局部侵犯。胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumor, NET)是一種相對少見的腫瘤，占所有胰腺腫瘤的1%～2%，具有比SPN更廣的生物學(xué)譜系。由于兩者形態(tài)學(xué)極其相似，部分SPN會發(fā)生神經(jīng)內(nèi)分泌分化，因此有必要采用免疫組化法鑒別兩者。傳統(tǒng)的免疫組化標(biāo)志物特異性不高，時常給鑒別診斷帶來困難。Claudin蛋白是緊密連接(tight junction)蛋白家族，在許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，近年來發(fā)現(xiàn)其在鑒別胰腺腫瘤中具有一定的意義。本文采用免疫組化EnVision法檢測20例SPN和23例NET中Claudin5和Claudin7中的表達(dá)，探討兩者對鑒別診斷SPN和NET的意義。

1 材料與方法

1.1材料收集湖北省黃岡市中心醫(yī)院、武漢市中心醫(yī)院和浙江省紹興市第一人民醫(yī)院2009年8月～2016年6月期間手術(shù)切除的20例SPN和23例NET標(biāo)本。SPN診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤分類[1]。NET的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照(2017)胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理診斷規(guī)范[2]，依據(jù)核分裂象(<2；≥2，≤20；>20)和Ki-67陽性指數(shù)(≤2%；>2%，≤20%；>20%)將高分化神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tunor, NET)組織學(xué)分為G1(低)、G2(中)和G3(高)。所有病例均由兩名高年資病理醫(yī)師復(fù)核。

1.2方法所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水透明浸蠟切片，HE染色，同時行免疫組化染色。對所有標(biāo)本行免疫組化EnVision兩步法檢測，所用一抗包括Claudin5兔單克隆抗體(購自Abcam公司，ab15106，稀釋度1 ∶500)、Claudin7兔單克隆抗體(Abcam公司，ab27487，稀釋度1 ∶1 000)。β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR均為工作液，二抗和DAB試劑盒購自北京中杉金橋公司。Claudin5和Claudin7抗體經(jīng)1 mmol/L pH 9.0的EDTA緩沖液，其余抗體經(jīng)10 mmol/L pH 6.0枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復(fù)后，按照使用說明書進(jìn)行操作。用已知Claudin5陽性的血管瘤、Claudin7陽性的食管鱗狀細(xì)胞癌作陽性對照，用PBS取代一抗作陰性對照。

1.3結(jié)果判定所有一抗的染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分級，根據(jù)腫瘤細(xì)胞膜、質(zhì)及核中出現(xiàn)黃色、棕黃色及棕褐色顆粒，觀察每張切片中10個具有代表性的高倍視野，計算腫瘤細(xì)胞數(shù)，陽性結(jié)果評分分為2類：0～5%為陰性(-)；≥5%為陽性(+)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩種腫瘤單個免疫標(biāo)志物陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床特征20例SPN中，男性3例，女性17例；年齡10～48歲，中位年齡27歲；腫瘤直徑4.6～8.5 cm；其中腫瘤位于胰頭6例、胰體6例、胰尾8例；4例發(fā)生出血、囊性變；5例發(fā)生周圍纖維包膜侵犯；1例腹腔轉(zhuǎn)移。8例患者有腹痛、腹脹等癥狀，12例體檢時被偶然發(fā)現(xiàn)。23例NET中，男性12例，女性11例；年齡32～57歲，中位年齡43歲；腫瘤直徑1.4～4.8 cm；其中位于胰頭5例、胰體11例、胰尾7例；組織學(xué)分級：G1型13例、G2型10例；1例發(fā)生出血、壞死；15例為無功能性腫瘤，8例有相應(yīng)的臨床癥狀；所有病例均未見轉(zhuǎn)移。

2.2鏡檢20例SPN主要由實(shí)性區(qū)、假乳頭區(qū)及退變區(qū)呈不同比例構(gòu)成，部分外層見纖維包膜。實(shí)體區(qū)見腫瘤細(xì)胞呈大片巢狀、條索狀排列，分布于玻璃樣變的纖維血管間。腫瘤細(xì)胞大小較一致，異型性小，圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)較少、淡染，核圓形，可見核溝，未見核仁，少見核分裂。假乳頭區(qū)見腫瘤細(xì)胞呈單層或多層排列，圍繞纖維血管為軸心形成假乳頭狀或假菊形團(tuán)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)與實(shí)體區(qū)相似。退變區(qū)可見出血、壞死，常見組織細(xì)胞浸潤及膽固醇結(jié)晶。腫瘤內(nèi)見殘存的胰腺腺泡及導(dǎo)管。23例NET未見包膜，腫瘤細(xì)胞呈實(shí)體樣、梁狀、腺樣及腦回樣結(jié)構(gòu)排列，間質(zhì)為纖維組織，部分玻璃樣變。腫瘤細(xì)胞大小、形態(tài)一致，呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)少。

2.3免疫表型

2.3.1Claudin5診斷SPN的特異性和敏感性 Claudin5在SPN的腫瘤細(xì)胞中均呈彌漫強(qiáng)陽性膜表達(dá)(圖1A、B)，其陽性率為100%(20/20)；Claudin5在23例NET中陽性率為13.0%(3/23)，呈胞質(zhì)陽性表達(dá)(圖1C)，強(qiáng)弱不等；其陽性率在兩腫瘤之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。Claudin5在診斷SPN中的敏感性為100%，特異性為87.0%；此外，本組實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)Claudin5在43例胰腺腫瘤間質(zhì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中均呈胞質(zhì)彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)(圖1D)。

2.3.2Claudin7診斷胰腺NET的特異性和敏感性 Claudin7在20例SPN腫瘤細(xì)胞中均不表達(dá)(圖2A)，陽性率為0.0(0/20)；Claudin7在23例NET中的陽性率為100%(23/23)，呈彌漫強(qiáng)陽性膜表達(dá)(圖2B)，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。Claudin7診斷NET的敏感性為100%，特異性為100%。

2.3.38種常規(guī)標(biāo)志物在SPN和NET中表達(dá)的差異性 SPN中β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR的陽性率分別為90.0%(18/20)、80.0%(16/20)、65.0%(13/20)、95.0%(19/20)、80.0%(16/20)、90.0%(18/20)、75.0%(15/20)、70.0%(14/20)；NET中β-catenin、CD10、CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR的陽性率分別為47.8%(11/23)、30.4%(7/23)、69.6%(16/23)、78.2%(18/23)、82.6%(19/23)、95.7%(22/23)、87.0%(20/23)、60.9%(14/23)。其中β-catenin和CD10在SPN和NET中的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；β-catenin診斷SPN的敏感性為90.0%，特異性為52.2%；CD10診斷SPN的敏感性為80.0%，特異性為69.6%。其余CK、vimentin、CD99、NSE、Syn、PR在SPN和NET中的陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05，表1)。

①A①B①C①D②A②B

圖1Claudin5的表達(dá)模式：A.胰腺實(shí)性-假乳頭狀腫瘤假乳頭狀區(qū)域中的表達(dá)；B.胰腺實(shí)性-假乳頭狀腫瘤實(shí)性區(qū)域中的表達(dá)；C. 胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達(dá)；D.胰腺腫瘤間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，EnVision法圖2Claudin7的表達(dá)模式：A.胰腺實(shí)性-假乳頭狀腫瘤中的表達(dá)；B.胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達(dá)，EnVision法

表1 10種標(biāo)志物在SPN和NET中的陽性率差異性

3 討論

SPN于1959年由Frantz首先報道。其曾經(jīng)被認(rèn)為良性腫瘤，該腫瘤曾被命名為胰腺實(shí)性-乳頭狀囊性腫瘤、乳頭狀囊性腫瘤、Hamoudi或Frantz瘤。WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤分類將該腫瘤命名為SPN[1]，認(rèn)為其是一種低級別惡性腫瘤。關(guān)于SPN的組織學(xué)發(fā)生目前處于爭議之中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其起源于胰腺原始多功能干細(xì)胞或胚胎神經(jīng)嵴細(xì)胞[3]。SPN的大多數(shù)患者為年輕女性，多數(shù)患者無明顯癥狀，偶爾體檢發(fā)現(xiàn)腫瘤。周圍神經(jīng)、胰腺間質(zhì)和淋巴血管侵犯可以預(yù)測患者的預(yù)后，但并不能提示惡性?；颊邽槟行?、年齡較輕、腫瘤直徑>5 cm及腫瘤核分裂象增多則會提示腫瘤為惡性[4]。大體觀察SPN被纖維組織包裹，與周圍正常的胰腺組織分界清楚；鏡下組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)包含實(shí)體區(qū)、假乳頭狀結(jié)構(gòu)及囊性變。當(dāng)SPN腫瘤體積較小且發(fā)生神經(jīng)內(nèi)分泌分化或者腫瘤完全由實(shí)體區(qū)構(gòu)成時，則與胰腺高分化NET鑒別較困難。SPN的假乳頭狀結(jié)構(gòu)與NET的腺樣結(jié)構(gòu)或假菊形團(tuán)結(jié)構(gòu)容易混淆。SPN的玻璃樣變間質(zhì)與NET淀粉樣間質(zhì)也不易區(qū)分。在細(xì)胞學(xué)方面：雖然SPN腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)大的、清晰的細(xì)胞質(zhì)空泡變性和Cercariform細(xì)胞有助于區(qū)分NET[5]。但是，兩者具有更多相似的細(xì)胞學(xué)特征，如兩者均具有從中等到較多的細(xì)胞數(shù)量，大小、形態(tài)一致，均可呈多角形、立方狀，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性或透明，偶爾呈現(xiàn)漿細(xì)胞樣外觀，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，核質(zhì)比較低，核分裂少見，具有明顯的核仁[6]。由于兩者的生物學(xué)行為不同，采用免疫組化法檢測必不可少。目前，診斷和鑒別SPN和NET標(biāo)志物主要有P504S、CD10、E-cadherin/β-catenin、CK、Axin-1、vimentin、PR、AAT、Syn、CgA及CD56等。

Claudin蛋白屬于完整的緊密連接(tight junction, TJ)膜蛋白家族成員，在維持上皮細(xì)胞極向、黏附性和細(xì)胞旁通透性中起重要作用，與細(xì)胞某些功能失常和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。目前在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有24余種Claudin蛋白。除Claudin13外，人類有23種Claudin基因得到識別和定位。相比正常的組織，Claudins蛋白在不同的腫瘤組織中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，部分蛋白表達(dá)下降或者過表達(dá)均與腫瘤的發(fā)生及患者的預(yù)后有關(guān)，可能是腫瘤治療的靶位[7]。Claudin5在TJ蛋白中起內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，通過直接調(diào)節(jié)ERG基因轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮作用，其在大腦、肺的所有節(jié)段的血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎臟入球小動脈、出球小動脈中呈過表達(dá)[8]。通過對本組43例胰腺腫瘤檢測，發(fā)現(xiàn)所有的腫瘤間質(zhì)中的血管內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)均可見Claudin5表達(dá)，與文獻(xiàn)報道相符。Claudin7蛋白在許多腫瘤組織中出現(xiàn)下調(diào)，其表達(dá)減少誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞失去鈣黏附蛋白，促進(jìn)細(xì)胞增生、侵襲；同時，其還可以通過ERK/MAPK細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制腫瘤細(xì)胞遷徙和侵襲[9]。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Claudin5和Claudin7可以用來鑒別胰腺的SPN和NET。Comper等[10]檢測20例胰腺SPT、20例無功能內(nèi)分泌腫瘤、7例腺泡細(xì)胞癌和2例胰母細(xì)胞瘤發(fā)現(xiàn)Claudin5在所有的SPT中呈強(qiáng)陽性膜表達(dá)，Claudin7則在少數(shù)病例中呈胞質(zhì)陽性表達(dá)；相反，所有的內(nèi)分泌腫瘤、腺泡細(xì)胞癌和胰母細(xì)胞瘤則呈Claudin7強(qiáng)陽性膜表達(dá)，Claudin5則全部為陰性；因此，這種表達(dá)模式有助于區(qū)分SPT和其他胰腺腫瘤。國內(nèi)鄭洪彥等[11]發(fā)現(xiàn)Claudin5具有相同的鑒別作用。然而，也有學(xué)者認(rèn)為Claudin7在細(xì)胞質(zhì)中呈陽性是SPN的獨(dú)特特征[12]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：20例SPN均呈Claudin5膜強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性率為100%(20/20)，3例NET呈Claudin5胞質(zhì)陽性表達(dá)，染色信號強(qiáng)弱不等；23例NET均呈Claudin7胞膜強(qiáng)陽性，其陽性率為100%(23/23)，Claudin7在所有SPN中均陰性。Claudin5和Claudin7在兩者中的陽性率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Claudin5診斷SPN的敏感性為100%，特異性為87.0%；Claudin7診斷胰腺NET的敏感性為100%，特異性為100%。作者推測Claudin5和Claudin7在胰腺SPT和NET的不同表達(dá)模式可能與兩種蛋白分別參與不同腫瘤細(xì)胞間的黏附性有關(guān)。

在SPN中普遍發(fā)生的Wnt/β-catenin信號通路異常從而導(dǎo)致CTNNB1外顯子3中的β-catenin基因激活是重要的分子機(jī)制，因此Wnt/β-catenin信號通路是SPN的致瘤因子[13]。聯(lián)合檢測E-cadherin/β-catenin和CD10有助于診斷和鑒別診斷SPN和NET。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論支持上述結(jié)論。其余CD99、CK、Syn、CgA、CK、PR、AAT等標(biāo)志物在不同研究中結(jié)論不同[14-15]，在兩種腫瘤中出現(xiàn)的免疫表型重疊，鑒別仍舊存在困難。Claudin5和Claudin7分別在SPN和NET中呈腫瘤細(xì)胞膜的陽性表達(dá)模式，具有較高的特異性和敏感性，本實(shí)驗(yàn)通過聯(lián)合檢測Claudin5、β-catenin、CD10和Claudin7可以有效地鑒別SPN和NET。

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R 735.9

A

1001-7399(2017)10-1122-04

時間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.014.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.014

接受日期：2017-05-25

1湖北省黃岡市中心醫(yī)院病理科，黃岡 438000

2浙江省紹興市第一人民醫(yī)院病理科，紹興 312000

3湖北省武漢市中心醫(yī)院病理科，武漢 430010

4湖北省武漢市第六醫(yī)院病理科，武漢 430000

5華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理研究所/同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，武漢 430030

曹 鐘，男，碩士，副主任醫(yī)師。Tel: (0713) 8625273，E-mail: caozhong1980@sina.com

敖啟林，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: aoqilin@263.net