李 禹，程愛蘭

胃癌組織中CTSD、HSP90α、EGFR的表達(dá)及臨床意義

李 禹1,2，程愛蘭1

目的檢測(cè)組織蛋白酶D(Cathepsin D, CTSD)、熱休克蛋白90α(heat shock protein 90α, HSP90α)、表皮生長因子受體(epidemal growth factor receptor, EGFR)蛋白及其mRNA在胃癌組織中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，初步探討CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移過程中的作用。方法采用免疫組化及原位雜交(in situ hybridization, ISH)法檢測(cè)110例正常胃黏膜組織、83例癌旁異型增生組織、110例胃癌組織及78例胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中CTSD、HSP90α、EGFR蛋白及其mRNA的表達(dá)。結(jié)果(1)CTSD、HSP90α、EGFR蛋白在110例正常胃黏膜組織、83例癌旁異型增生組織、110例胃癌組織及78例胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的陽性率分別為0、18.07%、80.91%、92.31%；0.9%、15.66%、75.45%、89.74%；0、12.05%、69.09%、84.62%。(2)相關(guān)分析結(jié)果顯示，CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌組織中的表達(dá)呈兩兩正相關(guān)(rs=0.853，P<0.05；rs=0.639，P<0.05；rs=0.734，P<0.05)。(3)CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌中的表達(dá)均與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤大小無顯著相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論CTSD、HSP90α與EGFR可能與胃癌發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

胃腫瘤；CTSD；HSP90α；EGFR；臨床病理特征

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。我國胃癌的發(fā)病率及病死率均明顯高于全球平均水平。在前期工作中，課題組利用蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)方法篩選并鑒定了高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞中組織蛋白酶D(Cathepsin D, CTSD)的相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn)CTSD/熱休克蛋白90α(heat shock protein 90α, HSP90α)/表皮生長因子受體(epidemal growth factor receptor, EGFR)在鼻咽癌細(xì)胞中形成相互作用組并能促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移[1]，CTSD/HSP90α/EGFR在胃癌中是否也具有協(xié)同作用及促進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移尚不明確。本文采用免疫組化及原位雜交(in situ hybridization, ISH)法檢測(cè)不同胃病變組織中CTSD、HSP90α和EGFR蛋白及其mRNA的表達(dá)，旨在探討它們與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為尋找胃癌腫瘤標(biāo)志物提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1一般材料收集2014年7月～2015年6月南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院存檔的胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，包括正常胃黏膜組織110例、異型增生組織83例、胃癌組織110例和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性癌組織78例，其中男性73例，女性37例；年齡27～81歲，平均58.29歲。分化程度：高分化6例，中分化20例，低+未分化84例；無區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，1～6枚區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，7～15枚區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，>15枚區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例；浸潤深度：腫瘤浸潤至固有層及黏膜下層9例，肌層29例，漿膜層72例；腫瘤直徑：≥6 cm者23例，<6 cm者87例。TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期25例，Ⅲ期59例，Ⅳ期6例。以上病理結(jié)果均經(jīng)兩名以上病理醫(yī)師確認(rèn)。所有患者術(shù)前均未行放療或化療。

1.2試劑CTSD抗體及SP免疫組化檢測(cè)試劑盒購自福州邁新公司，HSP90α抗體、CTSD和EGFR ISH試劑盒均購自武漢博士德公司，兔抗EGFR抗體購自北京中杉金橋公司，HSP90α ISH試劑盒購自廣州伯信公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化 采用免疫組化SP法染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，分別滴加3%H2O2內(nèi)源性過氧化物酶抑制劑10 min，PBS緩沖液沖洗，滴加CTSD、HSP90α、EGFR一抗后4 ℃冰箱過夜，次日分別滴加二抗和SP溶液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2ISH 切片常規(guī)脫蠟水化，0.25%乙酸酐酸化，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段，后固定，預(yù)雜交，雜交，雜交后洗滌，封閉，滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過氧化物酶后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定性資料的比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，各指標(biāo)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析；采用Kappa檢驗(yàn)比較其免疫組化和ISH的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1CTSD、HSP90α、EGFR蛋白及其相應(yīng)mRNA在不同胃病變中的表達(dá)CTSD、HSP90α、EGFR蛋白在110例正常胃黏膜組織、83例癌旁異型增生組織、110例胃癌組織及78例胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(圖1)中的陽性率分別為0、18.07%、80.91%、92.31%；0.9%、15.66%、75.45%、89.74%；0、12.05%、69.09%、84.62%。相應(yīng)CTSD mRNA、HSP90α mRNA、EGFR mRNA(圖2)的陽性率分別為0、7.22%、65.45%、76.92%；0、14.46%、60.91%、67.95%；0、12.05%、60.91%、75.64%(表1)。

2.2CTSD、HSP90α和EGFR蛋白與mRNA表達(dá)的一致性分析Kappa檢驗(yàn)，CTSD、HSP90α和EGFR與其相應(yīng)的mRNA在胃癌組織中的表達(dá)均具有一致性(κ=0.603，P<0.05；κ=0.700，P<0.05；κ=0.455，P<0.05)。

2.3胃癌組織中CTSD、HSP90α與EGFR三者之間的關(guān)系相關(guān)分析結(jié)果顯示，CTSD與HSP90α、CTSD與EGFR、HSP90α與EGFR在胃癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.853，P<0.05；rs=0.639，P<0.05；rs=0.734，P<0.05)。

①A①B①C②A②B②C

圖1胃癌組織中CTSD、HSP90α和EGFR蛋白的表達(dá)：A.CTSD；B.HSP90α；C.EGFR，SP法圖2胃癌組織中CTSD mRNA、HSP90α mRNA和EGFR mRNA的表達(dá)：A.CTSD；B.HSP90α；C.EGFR，ISH

表1 不同胃組織中CTSD、HSP90α、EGFR蛋白及其相應(yīng)mRNA的表達(dá)

胃癌vs正常胃黏膜組織，P<0.05；胃癌vs癌旁異型增生組織，P<0.05；胃癌vs胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，P<0.05

2.4CTSD、HSP90α、EGFR表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系CTSD、HSP90α、EGFR表達(dá)均與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤大小無顯著相關(guān)性(P>0.05，表2)。

表2 CTSD、HSP90α、EGFR表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

近年研究認(rèn)為胃癌是由多種內(nèi)外因素介導(dǎo)細(xì)胞多種基因結(jié)構(gòu)損傷和表達(dá)異常所致，是多步驟的復(fù)雜過程，其發(fā)生過程中涉及大量癌基因的活化和抑癌基因的失活。因此研究與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因或蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)具有診斷意義的腫瘤標(biāo)志物，一直是亟待解決的課題。

CTSD是一種廣泛存在于不同組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的溶酶體天冬氨酸類肽鏈內(nèi)切酶，因其生物學(xué)功能多樣性而倍受關(guān)注。Nirdé等[2]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞過表達(dá)CTSD可通過促進(jìn)HSP70的分泌來促進(jìn)高密度腫瘤細(xì)胞的增生。Vashishta等[3]采用轉(zhuǎn)染方法使低分泌CTSD的NCI-H23肺癌細(xì)胞系大量分泌CTSD，發(fā)現(xiàn)NCI-H23細(xì)胞系的侵襲和轉(zhuǎn)移潛能顯著增強(qiáng)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CTSD在高分化胃癌組織、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的表達(dá)水平顯著低于中～未分化胃癌組織及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，且浸潤深度越深、TNM分期越高，CTSD的表達(dá)水平越高，提示CTSD的異常表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用，與徐曉艷等[4]、Dian等[5]的研究結(jié)果基本一致。

HSP90α是一種伴侶蛋白，輔助蛋白折疊，在腫瘤細(xì)胞中，HSP90α能夠使過度激活或突變的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白保持活性，加速腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變。同時(shí)，HSP90α也能調(diào)控整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及黏著斑的穩(wěn)定和功能、影響腫瘤血管形成，參與一些腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。有研究表明，在胃癌、胰腺癌等實(shí)體腫瘤中HSP90α高表達(dá)且HSP90α表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分期等密切相關(guān)，其表達(dá)越高，預(yù)示預(yù)后越差[6-7]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分化程度越低、浸潤深度越深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)越多，胃癌組織中HSP90α的表達(dá)水平越高。這些結(jié)果提示HSP90α對(duì)胃癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移可能有一定的作用，與王佳泓等[8]報(bào)道的在胃癌組織中HSP90表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、TNM分期相關(guān)的結(jié)果基本一致。

已有研究表明，如大腸癌、胃癌以及食管癌等上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤均存在EGFR蛋白的表達(dá)及過表達(dá)現(xiàn)象，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制癌細(xì)胞的凋亡[9-10]。Weng等[11]采用DNA甲基化檢測(cè)顯示EGFR啟動(dòng)子甲基化可能是胃癌發(fā)生、發(fā)展的表觀遺傳學(xué)的生物標(biāo)志。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在胃癌組織中EGFR表達(dá)均與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、TNM分期相關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)，提示EGFR的過度激活在胃黏膜正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程以及胃癌組織中惡性細(xì)胞的演進(jìn)過程中扮演重要角色。

王婭蘭等[12]利用免疫組化法檢測(cè)結(jié)直腸癌中CTSD與EGFR的表達(dá)，兩者呈正相關(guān)，且CTSD陽性者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于陰性者，并認(rèn)為EGFR可以增加CTSD轉(zhuǎn)錄，從而與促進(jìn)其分泌有關(guān)。陳春鳳等[13]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌中EGFR與CTSD表達(dá)呈明顯正相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)CTSD與EGFR表達(dá)具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤發(fā)展。劉世全等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示食管鱗狀細(xì)胞癌中EGFR與HSP90α的表達(dá)呈正相關(guān)，且兩者表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)及TNM分期呈正相關(guān)，并認(rèn)為這可能與HSP90α作為分子伴侶可協(xié)助EGFR維持其基本功能有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTSD、HSP90α及EGFR呈兩兩正相關(guān)，提示CTSD、HSP90α及EGFR可能在胃癌中形成相互作用組并共同促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移，而具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

總之，CTSD、HSP90α與EGFR的表達(dá)水平可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。

[1] Cheng A L, Huang W G, Chen Z C,etal. Identificating cathepsin D as a biomarker for differentiation and prognosis of nasopharyngeal carcinoma by laser capture microdissection and proteomic analysis[J]. J Proteome Res, 2008,7(6):2415-2426.

[2] Nirdé P, Derocq D, Maynadier M,etal. Heat shock cognate 70 protein secretion as a new growth arrest signal for cancer cells[J]. Oncogene, 2010,29(1):117-127.

[3] Vashishta A, Ohri S S, Proctor M,etal. Ribozyme-targeting procathepsin D and its effect on invasion and growth of breast cancer cells: an implication in breast cancer therapy[J]. Int J Oncol, 2007,30(5):1223-1230.

[4] 徐曉艷, 范鵬程, 馬秀梅. E-鈣黏附素、組織蛋白酶D與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,39(3):237-241.

[5] Dian D, Vrekoussis T, Shabani N,etal. Expression of cathepsin-D in primary breast cancer and corresponding local recurrence or metastasis:an immunohistochemical study[J]. Anticancer Res, 2012,32(3):901-906.

[6] Wang J, Cui S, Zhang X,etal. High expression of heat shock protein 90 is associated with tumor aggressiveness and poor prognosis in patients with advanced gastric cancer[J]. PLoS One, 2013,8(4):e62876.

[7] Jiang H, Duan B, He C,etal. Cytoplasmic HSP90α expression is associated with perineural invasion in pancreatic cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(6):3305-3311.

[8] 王佳泓, 崔書中, 張相良, 等. 進(jìn)展期胃癌HSP90的表達(dá)及其臨床意義[J]. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2013,18(8):394-397.

[9] 劉 萍, 李云峰, 李 強(qiáng), 等. EGFR、αVβ3、ADAM23 在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 實(shí)用癌癥雜志, 2016,31(1):1-3.

[10] Hedner C, Borg D, Nodin B,etal. Expression and prognostic significance of human epidermal growth factor receptors 1 and 3 in gastric and esophageal denocarcinoma[J]. PLoS One, 2016,11(2):e0148101.

[11] Weng X, Zhang H, Ye J,etal. Hypermethylated epidermal growth factor receptor (EGFR) promoter is associated with gastric cancer[J]. Sci Rep, 2015,5:10154.

[12] 王婭蘭, 苗德林, 周 偉. 大腸癌組織蛋白酶D表達(dá)及其與EGFR, PCNA表達(dá)的關(guān)系[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 1998,14(3):261-263.

[13] 陳春風(fēng), 趙俊軍. CathD、CD44V6和EGFR在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及意義[J]. 中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2009,26(3):256-258.

[14] 劉世全. 食管鱗癌及食管胃交接部腺癌中EGFR、HER-2及Hsp90α的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響[D]. 石家莊: 河北醫(yī)科大學(xué), 2014.

ExpressionofCTSD,HSP90αandEGFRingastriccancerand
theirclinicalsignificance

LI Yu1,2, CHENG Ai-lan1

(1CancerResearchInstitute,KeyLaboratoryofTumourCellandMolecularPathology,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;2AnxiangPeople’sHospital,Changde415600,China)

PurposeTo detect the expression of Cathepsin D(CTSD), heat shock protein 90α (HSP90α) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in gastric cancer(GC) tissues and to analyze the association of their expression levels and clinical pathological features of GC, the role of CTSD, HSP90α, EGFR in the carcinogenesis, progression, invasion and metastasis of GC.MethodsThe expression of CTSD, HSP90α and EGFR in normal gastric mucosa, dysplasia adjacent to carcinoma, GC tissues and lymph node metastasis was measured by immunohistochemistry (IHC) and in situ hybridization (ISH).ResultsIn 110 cases of normal gastric mucosa, 83 cases of dysplasia adjacent to carcinoma, 110 cases of GC and 78 cases of the lymph node metastasis, the positive rate of CTSD, HSP90α, EGFR protein was 0, 18.7%, 80.91% and 92.31%, 0.9%, 15.66%, 75.45% and 89.74%, 0, 12.05%, 69.09% and 84.62%, respectively. Correlation analysis showed that the expression CTSD, HSP90α and EGFR in GC tissues was positively correlated (rs=0.853,P<0.05,rs=0.639,P<0.05,rs=0.734,P<0.05). Expression of CTSD, HSP90α and EGFR in GC was correlated with the degree of tumor differentiation, invasive depth, number of lymph node metastasis and TNM stages (P<0.05). There was no significant correlation with the patient's age, sex, tumor size (P>0.05).ConclusionCTSD, HSP90α and EGFR may be associated with malignant behavior, development and invasion and metastasis of GC.

gastric neoplasms; CTSD; HSP90α; EGFR; clinicopathologic features

R 735.2

A

1001-7399(2017)10-1074-04

時(shí)間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.003.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.003

接受日期：2017-08-16

國家自然科學(xué)基金(81372894、81072198)、湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(10A104)

1南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，衡陽 421001

2湖南省常德市安鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院病理科，常德 415600

李 禹，女，碩士，醫(yī)師。E-mail: 526756791@qq.com

程愛蘭，女，博士，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: ailan_cheng@hotmail.com