曹 嬿，范松龍，張智弘

胃癌中RBBP4和BCL-2的表達(dá)及意義

曹 嬿1,2，范松龍2，張智弘1

目的探討視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白4(retinoblastoma binding protein 4, RBBP4)和BCL-2在胃癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組化SP法檢測72例胃癌及對應(yīng)癌旁組織中RBBP4、BCL-2蛋白表達(dá)，分析RBBP4與胃癌臨床病理特征的關(guān)系及與BCL-2表達(dá)的相關(guān)性。實時熒光定量PCR法檢測20例胃癌及癌旁組織中RBBP4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果RBBP4、BCL-2蛋白在癌組織中的陽性率分別為55.6%(40/72)、50%(36/72)，顯著高于癌旁組織13.9%、16.7%。RBBP4和BCL-2高表達(dá)均與腫瘤分化、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)，且RBBP4和BCL-2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.559，P<0.05)。RBBP4 mRNA在胃癌組織中的相對表達(dá)水平(9.988±1.948)顯著高于癌旁組織(1.458±0.489)。結(jié)論RBBP4在胃癌中的表達(dá)升高，可能和胃癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能成為胃癌診斷和預(yù)后評估的新指標(biāo)。

胃腫瘤；RBBP4；BCL-2；免疫組織化學(xué)；實時熒光定量PCR

胃癌病死率高居癌癥相關(guān)病死率的第3位，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。除早期胃癌外，進(jìn)展期胃癌復(fù)發(fā)率高，預(yù)后很差，5年生存率為5%～20%[2]。因此尋找新的分子標(biāo)志物對實施個體化治療和預(yù)后判斷尤為重要。近年研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白4(retinoblastoma binding protein 4, RBBP4)與腫瘤的增殖、復(fù)發(fā)、治療抵抗有密切關(guān)系[3-4]。有文獻(xiàn)報道RBBP4在前列腺癌[5]、肝細(xì)胞肝癌[6]、子宮頸癌[7]中高表達(dá)，但在胃癌中報道較少且不明確。本文通過檢測RBBP4在胃癌中的表達(dá)，分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，同時檢測腫瘤凋亡相關(guān)因子BCL-2的表達(dá)，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性及意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料選取常州市中醫(yī)醫(yī)院病理科2012年～2015年存檔的胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，按WHO(2010)胃癌組織學(xué)分級及分類標(biāo)準(zhǔn)診斷。所有病例術(shù)前均未行放、化療等抗腫瘤治療。標(biāo)本送至病理科后規(guī)范固定、取材、常規(guī)脫水并制成蠟塊。選取有代表性的腫瘤組織和正常組織蠟塊，免疫組化法檢測RBBP4和BCL-2蛋白表達(dá)，同時以實時熒光定量PCR法檢測其中20例胃癌組織和癌旁組織中RBBP4 mRNA的表達(dá)。

1.2方法

1.2.1試劑 免疫組化抗體：鼠抗人RBBP4單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1 ∶200)，鼠抗人BCL-2單克隆抗體(即用型)，免疫組化試劑盒購自北京西雅金橋公司。PureLink FFPE Total RNA Isolation Kit(Invitrogen公司)用于提取RNA，High-Capacity cDNA Reverse Transcriptipon Kit(ABI公司)用于逆轉(zhuǎn)錄，PCR試劑盒Power SYBR Green master mix(ABI公司)用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化SP法檢測胃癌及癌旁組織中RBBP4、BCL-2蛋白表達(dá)。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。結(jié)果判定：由兩位病理醫(yī)師分別閱片并結(jié)果判定。RBBP4特異性染色定位于細(xì)胞核，BCL-2主要表達(dá)在細(xì)胞核膜和細(xì)胞質(zhì)，染色陽性為出現(xiàn)黃色和棕黃色顆粒。每例鏡下采集10個低倍視野，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度綜合評分：(1)按陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。(2)按染色強(qiáng)度評分：無陽性染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.2.3實時熒光定量PCR 將選取好的腫瘤組織蠟塊20例分別切取白片3張，將白片放入去離子水中，用消毒的手術(shù)刀片對照HE染色切片的位置將腫瘤組織和腫瘤旁組織分別刮下，裝入離心管中，根據(jù)Invitrogen公司的PureLink FFPE Total RNA Isolation Kit的步驟進(jìn)行RNA提取，-80 ℃保存。通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，而后以cDNA產(chǎn)物為模板，設(shè)計合成PCR引物，引物序列：上游5′-TCTTTACAGGGCATACGG-3′，下游5′-TGAGTGGCTTGGTTTGGA-3′；β-actin上游5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′，下游5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，共進(jìn)行40個循環(huán)。設(shè)置管家基因β-actin為內(nèi)參照。反應(yīng)結(jié)束后由儀器自動分析結(jié)果，以2-△Ct及2-△△Ct計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 22.0和Graphpad 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Pearson χ2檢驗、校正的χ2檢驗這兩種統(tǒng)計檢驗方法和Spearman相關(guān)性分析，分析RBBP4、BCL-2表達(dá)與胃癌臨床病理特征之間的相關(guān)性，顯著性檢驗采用雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1胃癌組織與癌旁組織中RBBP4、BCL-2的表達(dá)胃癌組織中RBBP4、BCL-2的表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05，表1，圖1、2)。

表1 RBBP4和BCL-2在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)[n(%)]

①②

圖1胃癌中RBBP4陽性，SP法
圖2胃癌中BCL-2陽性，SP法

2.2RBBP4、BCL-2表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系RBBP4、BCL-2表達(dá)均與胃癌組織學(xué)分級、浸潤深度以及淋巴結(jié)侵犯密切相關(guān)(P<0.05)。而與患者年齡、性別、腫瘤大小和神經(jīng)侵犯與否無關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 RBBP4、BCL-2表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3胃癌組織中RBBP4與BCL-2表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織中RBBP4與BCL-2表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，表3)。

表3 胃癌組織中RBBP4與BCL-2的相關(guān)性

2.4胃癌及癌旁組織中RBBP4mRNA的表達(dá)實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，20例胃癌組織中RBBP4 mRNA的表達(dá)平均值為9.988±1.948，明顯高于20例癌旁組織RBBP4 mRNA表達(dá)水平(1.458±0.489)(P<0.000 1，圖3)。

3 討論

RBBP4屬于WD40蛋白家族，為一種Rb結(jié)合蛋白，參與染色體配置、核小體修飾、細(xì)胞周期進(jìn)展及腫瘤干細(xì)胞分化等功能[8-9]，并通過一系列中間環(huán)節(jié)，影響細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞增殖[10]，并且對腫瘤放、化療效果有一定影響[11-12]。RBBP4在不同腫瘤中的意義并不相同。原發(fā)性肝癌中RBBP4呈高表達(dá)，是一種癌基因[13]，在子宮頸癌細(xì)胞中，沉默RBBP4基因后其轉(zhuǎn)移、侵襲能力下降[7]。但既往也有研究報道RBBP4抑制子宮頸癌的發(fā)生[14]。本組實驗采用免疫組化法檢測胃癌和癌旁組織中RBBP4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RBBP4在胃癌組織中的表達(dá)(55.6%)明顯高于癌旁組織(13.9%)，進(jìn)一步應(yīng)用石蠟組織檢測RBBP4 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示胃癌組織中RBBP4 mRNA的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。這些實驗結(jié)果表明胃癌組織中RBBP4蛋白和mRNA表達(dá)水平均升高，提示RBBP4可能參與胃癌發(fā)生、發(fā)展，是一種促癌基因。此外，本組實驗深入分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，免疫組化結(jié)果顯示RBBP4表達(dá)與胃癌組織學(xué)分級、浸潤深度以及淋巴結(jié)侵犯密切相關(guān)，組織分化越差、浸潤能力越強(qiáng)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中RBBP4表達(dá)顯著升高，而這些因素均與腫瘤預(yù)后有關(guān)。這說明RBBP4表達(dá)水平能反映胃癌的進(jìn)展情況，可以作為判斷胃癌預(yù)后和早期診斷的新指標(biāo)。

圖3 RBBP4 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)

有研究報道RBBP4家族成員RBBP2通過上調(diào)BCL-2蛋白參與白血病的進(jìn)展[15]，因此作者也試圖通過分析胃癌中RBBP4與BCL-2的相關(guān)性來了解RBBP4在胃癌中的作用機(jī)制。本組實驗采用免疫組化法檢測BCL-2蛋白表達(dá)及其與RBBP4表達(dá)的相關(guān)性。BCL-2蛋白是與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的重要蛋白，具有很強(qiáng)的凋亡抑制功能，其過表達(dá)是腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的重要原因之一[16]。許多研究顯示胃癌中BCL-2蛋白高表達(dá)參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本組實驗結(jié)果顯示，BCL-2蛋白與RBBP4蛋白一樣，在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，與組織學(xué)分級、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且胃癌組織中RBBP4表達(dá)與BCL-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，即RBBP4可能通過促進(jìn)BCL-2蛋白的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本組實驗證實了RBBP4與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，可作為胃癌預(yù)后判斷重要指標(biāo)之一，且初步揭示了RBBP4與胃癌的關(guān)系可能是通過調(diào)控BCL-2凋亡細(xì)胞通路。本實驗仍處于初步階段，缺乏對患者生存時間的相關(guān)分析，且病例數(shù)仍不足，下一步需進(jìn)行更大樣本量的研究并隨訪收集相關(guān)數(shù)據(jù)，為RBBP4成為重要的預(yù)后指標(biāo)和靶向治療提供充足的證據(jù)。

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ExpressionofRBBP4andBCL-2ingastriccarcinomaand
theirclinicopathologicalsignificance

CAO Yan1,2, FAN Song-long2, ZHANG Zhi-hong1

(1DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China;2DepartmentofPathology,ChangzhouTraditionalChineseMedicineHospital,Changzhou213000,China)

PurposeTo investigate the expression and significance of RBBP4 and BCL-2 in gastric carcinoma and to explore the relationship between their expression and clinicopathologic characteristics.MethodsImmunohistochemistry was used to detect RBBP4 and BCL-2 proteins’ expression in the 72 tumor tissues and para-cancer tissues. The association of RBBP4 expression with the clinicopathologic features and the expression correlation between RBBP4 and BCL-2 were analyzed. Real-time PCR was used to detect the expression of RBBP4 mRNA in the 20 tumor tissues and corresponding para-cancer tissues.ResultsImmunohistochemical results showed that 40 cases of cancer tissues exhibited RBBP4 positive expression, with a positive rate of 55.6%, and 36 cases showed BCL-2 positive expression (50% positive rate), which were significantly higher than that in para-cancer mucosa (13.9%, 16.7%). The over-expression of RBBP4 and BCL-2 was correlated with tumor differentiation, invasive depth and lymphatic metastasis in gastric carcinoma (P<0.05). The expression of RBBP4 was positively correlated with BCL-2 (r=0.559,P<0.05). Real-time PCR results showed that the relative expression levels of RBBP4 mRNA in gastric carcinoma tissues and para-cancer tissues were 9.988±1.948 and 1.458±0.489 respectively, and the expression in gastric carcinoma was significantly up-regulated as compared with para-cancer tissues.ConclusionsThe expression of RBBP4 is up-regulated in gastric carcinoma, which may be involved in the development, invasion and metastasis of gastric carcinoma. RBBP4 might become a new diagnostic and prognostic marker for gastric carcinoma.

gastric neoplasms; RBBP4; BCL-2; immunohistochemistry; Real-time PCR

R 735.2

A

1001-7399(2017)10-1070-04

時間：2017-10-23 13:30 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.002.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.002

接受日期：2017-06-15

國家自然科學(xué)基金(81773109)、江蘇省自然科學(xué)基金(BK20151582)

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南京 210029

2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院病理科，常州 213000

曹 嬿，女，副主任醫(yī)師。E-mail: crossshine@163.com

張智弘，女，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師,通訊作者。E-mail: zhangzhih2001@aliyun.com