楊振麗 卞曉翠 馮海涼 劉玉琴

100005 北京，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 細胞資源中心

人源細胞系中6種主要病毒的檢測

楊振麗 卞曉翠 馮海涼 劉玉琴

100005 北京，中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 細胞資源中心

目的檢測人源細胞系中EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、人乳頭瘤病毒(Human pappilomavirus, HPV)、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、人T淋巴細胞白血病病毒(Human T-cell leukemia virus, HTLV)的感染情況。方法對中心庫藏常用的135株人源細胞系分別提取細胞DNA及RNA，采用PCR方法對細胞中的EBV、HBV、HPV、HIV、HTLV進行檢測；采用RT-PCR方法對細胞中的HCV進行檢測；利用透射電鏡觀察細胞中是否有病毒顆粒；對經PCR檢測HPV核酸片段陽性的細胞系，再利用特異性引物采用PCR方法檢測5種高危型HPV(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45)。結果經PCR檢測，135株細胞系中，有4株細胞系(Daudi、Raji、EB-3、NCI-BL2009)中檢測到EBV 核酸片段；2株細胞系(Hep3B、PLC/PRF/5)中檢測到HBV核酸片段；7株細胞系(HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3、SiHa、Ca Ski、CNE-2Z)中檢測到HPV核酸片段，其中2株(SiHa、Ca Ski)基因型為HPV16，5株(HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3、CNE-2Z)基因型為HPV18；1株細胞系(HUT 102)中檢測到HTLV核酸片段；沒有細胞系中檢測到HIV核酸片段；經RT-PCR檢測，沒有細胞系攜帶HCV核酸片段。透射電鏡下，病毒核酸陽性的細胞系中未觀察到病毒顆粒，部分細胞系內可見病毒包涵體類似物。結論PCR或RT-PCR可以用于檢測細胞系中病毒核酸的攜帶情況；細胞系中病毒核酸以基因組整合的形式存在。

細胞系在生命科學研究中是不可或缺的，其中大部分人源細胞系來源于患者組織，特別是腫瘤細胞系。病毒與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[1-4]，如乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)與肝癌、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)與丙型肝炎、EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)與淋巴瘤及鼻咽癌、人乳頭瘤病毒(Human pappilomavirus, HPV)與宮頸癌、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)與艾滋病、人T淋巴細胞白血病病毒(Human T-cell leukemia virus, HTLV)與T淋巴細胞白血病等。細胞中所攜帶的病毒或因細胞來源的患者本身感染了某種病毒，也或是由于某些原因而人為引入的外源病毒，如應用EBV感染B淋巴細胞從而建立B淋巴細胞系作為細胞模型用于實驗研究。本文通過PCR或RT-PCR及透射電鏡等方法對本中心庫藏的135株人源細胞系進行了檢測，并應用PCR的方法檢測了攜帶HPV核酸片段的細胞系中HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45等5種高危型的感染情況。

1 材料與方法

1.1材料所用細胞系及其培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等均由國家實驗細胞資源共享服務平臺中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心提供。DNA提取試劑盒Pure linkTMGenomic DNA Mini Kit購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒RNeasy? Mini kit及逆轉錄試劑盒QuantiTect? Reverse Transcription Kit購自Qiangen公司；所用引物由Invitrogen公司合成；2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE及100 bp DNA Ladder購自北京全式金生物技術有限公司；HCV RNA由北京大學肝病研究所提供。

1.2方法

1.2.1 細胞DNA及RNA提取:取對數(shù)生長期的細胞，按DNA提取試劑盒(Pure linkTMGenomic DNA Mini Kit)說明書提取細胞DNA，用于檢測EBV、HBV、HPV、HIV、HTLV核酸片段； 按RNA提取試劑盒(RNeasy? Mini kit)說明書提取細胞RNA，用于檢測HCV核酸片段。DNA及RNA分裝后-80 ℃保存。

1.2.2 cDNA合成:按逆轉錄試劑盒(QuantiTect? Reverse Transcription Kit)說明書將細胞RNA逆轉錄為cDNA，用于RT-PCR檢測HCV核酸片段，分裝后-80 ℃保存。

表1 PCR或RT-PCR檢測病毒核酸攜帶情況所用引物

1.2.3 引物設計:根據文獻報道及NCBI數(shù)據庫信息選取，并利用primer5.0軟件設計相應引物。所用引物經Blast比對驗證(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。

1.2.4 PCR反應:HBV陽性對照為Hep3B細胞的DNA；HCV陽性對照為HCV RNA經逆轉錄而獲得的cDNA；EBV陽性對照為B95-8細胞的DNA；HPV陽性對照為HeLa細胞的DNA; HIV 陽性對照為含HIV gag片段的質粒；HTLV 陽性對照為HUT 102細胞的DNA；以ddH2O為模板作為陰性對照。PCR體系為20 μl，其組份為：PCR super mix 10 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA或cDNA 1 μl (100 ng)，ddH2O補足至20 μl。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。

1.2.5 透射電鏡觀察:每種細胞約1×107個細胞，移入1.5 ml EP管中，離心，棄上清，加入1.5 ml新鮮配制的2.5%戊二醛固定液，4 ℃固定。由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所儀器中心電鏡室進行樣品制備，經透射電子顯微鏡TEM-1010進行觀察。

2 結果

2.1攜帶EBV核酸片段的細胞系對135株人源細胞系的DNA分別進行PCR擴增，以EBV引物擴增得到陽性產物的只有Daudi、Raji、EB-3、NCI-BL2009 細胞。而這4種細胞DNA，以其他引物進行擴增，沒有擴增出相應大小的陽性條帶。結果見圖1。

2.2攜帶HBV核酸片段的細胞系細胞DNA分別以HBV引物進行PCR擴增，只有Hep3B和PLC/PRF/5細胞可擴增出與陽性對照相應大小的條帶，而這2種細胞系以其他引物沒有擴增出陽性條帶。結果如圖2所示。

圖1 經PCR檢測攜帶EB病毒核酸片段的細胞系Fig.1 Detection of cell lines harbored EBV DNA sequences by PCR

圖2 經PCR檢測攜帶乙型肝炎病毒核酸片段的細胞系Fig.2 Detection of cell lines harbored HBV DNA sequences by PCR

圖3 經PCR檢測攜帶人乳頭瘤病毒核酸片段的細胞系Fig.3 Detection of cell lines harbored HPV DNA sequences by PCR

2.3攜帶HPV核酸片段的細胞系及高危型HPV檢測細胞DNA分別以HPV引物(MY09和MY11)進行PCR擴增，宮頸癌細胞HeLa、SiHa、Ca Ski的細胞DNA經HPV引物擴增后，可出現(xiàn)與陽性對照相一致的條帶，而其他引物沒有擴增出陽性條帶；HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3細胞與HeLa細胞結果一致；其中HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3細胞在基因型HPV18引物擴增下，可出現(xiàn)相應大小的陽性條帶，其他基因型引物無陽性擴增產物；SiHa、Ca Ski細胞經基因型HPV16引物擴增后，出現(xiàn)相應大小的陽性條帶，而其他基因型無陽性條帶。鼻咽癌細胞CNE-2Z細胞在HPV引物擴增下，可產生與陽性對照大小一致的條帶，而在其他引物擴增下沒有相應大小的陽性條帶；經基因型HPV18引物擴增后，可產生相應大小的陽性條帶。HPV檢測結果見圖3，高危型HPV檢測結果如表2所述。

表2 高危型人乳頭瘤病毒PCR檢測結果

2.4透射電鏡觀察細胞內病毒顆粒經透射電鏡觀察，未發(fā)現(xiàn)病毒核酸陽性的細胞中有病毒顆粒存在。但在細胞核和/或細胞質中發(fā)現(xiàn)了大小不均、個數(shù)不等的類似病毒包涵體的結構。高倍放大后觀察，可見該結構為大小均一的顆粒樣物質聚集而成，周圍無膜類物質包裹，但與周圍成份分界明顯。其中，該結構在Ca Ski、HeLa、HUT 102等細胞中較多(如圖4，黑色箭頭所示)；Daudi細胞中也有少量該結構；NCI-BL2009、PLC/PRF/5中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的以上結構。同時，在Raji細胞中發(fā)現(xiàn)含有類似管狀膜樣結構的包涵體樣結構(如圖4，白色箭頭所示)。

3 討論

細胞系多取材于患者的病灶組織，這些組織可能攜帶有病人自身感染的某些與疾病相關的病毒，導致細胞系中也會攜帶該病毒。因此，本研究選取部分人類易感染的致病病毒，如EBV、HBV、HCV、HPV、HIV、HTLV等作為檢測目標，應用PCR或RT-PCR及透射電鏡等方法對庫藏人源細胞系的病毒感染情況進行了檢測。

圖4 經透射電鏡觀察細胞內有病毒包涵體類似物Fig.4 Detection of viral inclusion bodies in cell lines by TEM

PCR或RT-PCR可用于檢測細胞系的病毒核酸攜帶情況。EBV、HBV、HPV為DNA病毒，HIV、HTLV為逆轉錄病毒，因此本研究采用PCR的方法檢測了細胞DNA；HCV為RNA病毒，因此本研究提取了細胞RNA采用RT-PCR的方法進行檢測。經檢測，本中心庫藏的135株人源細胞系中，共發(fā)現(xiàn)14株細胞系中存在相應病毒核酸片段。其中，攜帶EBV核酸片段的細胞系中，除NCI-BL2009細胞為EBV轉化的外周血B淋巴細胞外，其余3株均來自Burkitt淋巴瘤患者；攜帶HBV核酸片段的Hep3B和PLC/PRF/5細胞均來自肝癌患者；攜帶HPV18核酸片段的HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3細胞及攜帶HPV16核酸片段的SiHa、Ca Ski細胞均來自宮頸癌患者；鼻咽癌細胞CNE-2Z中未檢測到EBV核酸片段，但HPV擴增陽性，基因型為HPV18。由此可見，病毒在某些疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用[1-4，8]。

攜帶病毒核酸片段的細胞系中沒有完整的病毒顆粒。Uphoff等[6]通過檢測ZEBRA蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)只有個別細胞系經丁酸鈉及TAP誘導后才會產生病毒顆粒，病毒在細胞中主要以基因組整合及游離形式存在。本研究經透射電鏡進一步觀察，攜帶病毒核酸片段的細胞內未發(fā)現(xiàn)病毒顆粒，僅部分細胞系(Ca Ski、HeLa、HUT 102、Raji等)的細胞質和/或核內可見大小不等的包涵體類似物。說明在常規(guī)培養(yǎng)過程中，這些細胞系不會產生完整的病毒顆粒。這些包涵體類似物與細胞的培養(yǎng)時間等是否有關，其構成、功能及發(fā)生發(fā)展都鮮有報道，李慧弘等[9]在HeLa細胞中也發(fā)現(xiàn)了這種結構，認為由HPV L1構成。本實驗室也將繼續(xù)研究該結構在細胞系中的組成及作用。

綜上可見，應用針對不同病毒的特異性引物，經PCR或RT-PCR的方法檢測細胞系是否攜帶病毒核酸是可行的；以上檢測結果與文獻報道一致[6]，也進一步驗證了細胞系的正確性。所檢測到的攜帶病毒核酸片段的細胞系可作為研究病毒與疾病關系的細胞模型。某些細胞系中含有的病毒包涵體類似物仍需進一步研究。

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2017-05-03)

(本文編輯：呂新軍)

Detectionofsixmainspeciesofvirusesinhumancelllines

YangZhenli,BianXiaocui,FengHailiang,LiuYuqin

CellResourceCenter,InstituteofBasicMedicalSciencesChineseAcademyofMedicalSciences,SchoolofBasicMedicinePekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China

LiuYuqin,Email:liuyuqin@pumc.edu.cn

ObjectiveTo clarify the virus hosting status of human cell lines.MethodsThe DNA of Epstein-Barr virus (EBV), Hepatitis B virus (HBV), Human pappilomavirus (HPV), Human immunodeficiency virus (HIV), Human T-cell leukemia virus (HTLV) in 135 human cell lines were checked using PCR, and HCV RNA sequences were checked by RT-PCR. The transmission electron microscopy (TEM) was used to examine the virus particles in cells. The high-risk genotypes of HPV were tested by PCR.ResultsBy PCR assaying, among the 135 human cell lines, four cell lines(Daudi, Raji, EB-3, NCI-BL2009) harbored EBV DNA sequences; two(Hep3B, PLC/PRF/5) harbored HBV DNA sequences; seven (HeLa, HeLa 229, H1HeLa, HeLaS3, SiHa, Caski, CNE-2Z) harbored HPV DNA sequences, including two cell lines (SiHa, Caski) with HPV16, five cell lines(HeLa, HeLa 229, H1HeLa, HeLaS3, CNE-2Z) with HPV18; one cell line(HUT 102) harbored HTLV DNA sequences. No cell line harbored HCV RNA sequences and HIV DNA sequences. No viral particles were observed in the positive cell lines by TEM，but some viral inclusion bodies in certain cell lines.ConclusionsThe virus hosting status of human cell lines can be checked by PCR or RT-PCR. The viral DNA sequences were integrated in the cellular genome.

Cell lines; Virus; Polymerase chain reaction; Electron microscopy

劉玉琴，Email: liuyuqin@pumc.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.018

細胞系；病毒；聚合酶鏈式反應；電子顯微鏡