夏冬 宋娟 羅小暖 宋芹芹 王欣玲 武桂珍 韓俊

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒資源中心

·技術(shù)方法·

建立熒光定量PCR方法鑒定1例入境人員攜帶伊科普瑪病毒基因

夏冬 宋娟 羅小暖 宋芹芹 王欣玲 武桂珍 韓俊

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒資源中心

目的建立用于檢測伊科普瑪病毒(Ekpoma virus, EKV)基因的實時熒光定量PCR(qPCR)的檢測方法。方法根據(jù)GenBank中EKV-1和EKV-2基因的保守序列，設(shè)計引物和探針，建立檢測EKV-1和EKV-2基因的qPCR方法；使用建立的EKV-1和EKV-2病毒qPCR的檢測方法，對1名入境人員攜帶伊科普瑪病毒血清和全血樣本的檢測。結(jié)果建立了檢測EKV-1和EKV-2病毒Taqman探針的熒光定量qPCR檢測方法，成功檢測出1名安哥拉入境人員血清和全血樣本中攜帶EKV-2基因。結(jié)論建立的qPCR檢測方法可用于血液標(biāo)本中EKV-1和EKV-2的檢測。

伊科普瑪病毒屬于彈狀病毒科蒂布魯病毒屬(Tibrovirus)。彈狀病毒科是病毒顆粒形態(tài)呈棒狀或子彈狀的一類病毒，宿主范圍廣泛，其中已知與人類相關(guān)的有狂犬病毒屬、水皰病毒屬、蒂布魯病毒屬。蒂布魯病毒屬主要包括泰布羅加根病毒(Tibrogargan Virus)、下剛果病毒(Bas-Congo virus)、伊科普瑪病毒等[1-3]。

伊科普瑪病毒首次報道于2015年3月。當(dāng)時，美國研究小組在尼日利亞東南部地區(qū)進行不明原因急性發(fā)熱病例調(diào)查。通過二代測序技術(shù)，在作為對照組的健康人群血液中偶然發(fā)現(xiàn)兩個不同于已知病原的新基因序列。對這兩個全長約12 kb的基因組序列進行測定后，分別命名為EVK-1和EVK-2(2名健康人來自尼日利亞伊科普瑪村)。EKV病毒分為2型，分別為EKV-1和EKV-2[4]。

2017年2月，中國疾病預(yù)防和控制中心接到1例來自安哥拉的疑似攜帶伊科普瑪病毒基因的男性入境人員(體溫正常)報告。2017年3月29日，病毒病所接收到血清和全血樣本，通過熒光定量PCR方法再次確認(rèn)該男子血中攜帶EKV-2基因。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑熒光定量PCR儀(德國，Bio-Rad公司)； RNA病毒提取試劑盒(QIAamp Virus RNA Mini Kit，德國，QIAagen公司)；FastSYBR Mixture(CWBIO公司)；One-Step RT-PCR Mix(美國Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)。

1.2引物和探針的設(shè)計與合成通過查閱EKV-1型全基因組(GenBank，KP324827.1)和EKV-2型全基因組(GenBank，KP324828.1)，根據(jù)基因保守序列，設(shè)計引物和探針，擎科公司合成。

1.3標(biāo)準(zhǔn)品的制備選取EKV-1和EKV-2的保守序列，并合成276 bp和166 bp(由擎科公司和天一輝遠公司分別合成)后連接到pUC57-T Vector載體，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，提質(zhì)粒測定濃度定量。定量的標(biāo)準(zhǔn)品分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4檢測體系的建立

1.4.1 最適引物濃度的確定： 以上述標(biāo)準(zhǔn)品為模板，采用SYBR Green優(yōu)化PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系：2×Fast SYBR Green Mix 10 μl，模板2 μl。在Fast SYBR Green反應(yīng)體系中加入上、下游引物，引物濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 μmol/L，用水將體系補充至20 μl，通過Ct值和熒光信號rfu值確定合適的引物濃度。

1.4.2 最適退火溫度的確定： 設(shè)定45～60 ℃ 8個退火溫度，F(xiàn)ast SYBR Green PCR擴增反應(yīng)程序95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃ 30 s、45-60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，收集熒光信號，檢測熔解曲線。

1.4.3 探針濃度的篩選： 以上述標(biāo)準(zhǔn)品為模板對Taqman探針標(biāo)PCR體系的優(yōu)化，反應(yīng)體系：25×One-Step Mix 0.8 μl，2×Buffer 10 μl，模板2 μl。在反應(yīng)體系中分別加入0.5 μl上、下游引物，加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μl(濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 μmol/L)的探針，采用排列組合的方法選擇最佳的引物和探針濃度。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立： 以1×10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，根據(jù)上述優(yōu)化的體系建立PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，依次定量未知模板的濃度。以上述已稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板做PCR，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行敏感性確定。

1.5樣本檢測將送檢初篩患者的全血和血清標(biāo)本分裝后，于-80 ℃冰箱凍存。使用Qiagen Virus RNA Mini Kit提取RNA，合成CDNA,取2 μl cDNA，加入PCR體系進行檢測。

2 結(jié)果

2.1伊科普瑪病毒Taqman探針檢測方法的建立

2.1.1 EKV-1和 EKV-2病毒熒光定量PCR的引物和探針確定：選取EKV-1和 EKV-2病毒的基因保守區(qū)設(shè)計多對引物和探針，通過實驗比較，最終確定EKV-1的G蛋白基因位于4821-5056bp區(qū)域和EKV-2的U1蛋白基因位于2814-2933區(qū)域的保守序列為病毒鑒定引物和探針(表1)。

2.1.2 引物、探針濃度和退火溫度的確定:將引物濃度通過系列稀釋，成對配比，通過SYBR Green方法確定EKV-1、EKV-2引物終濃度為200～250nmol/L。將退火溫度從45 ℃至60 ℃設(shè)置8個溫度梯度進行篩選，確定50 ℃為EKV-1、EKV-2 PCR的最佳退火溫度，且獲得最適的Ct值和rfu值。將引物濃度和探針濃度進行系列配比，使用One-Step Mix PCR反應(yīng)體系，確定EKV-1病毒引物濃度為250 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L；EKV-2病毒引物濃度：250 nmol/L，探針濃度250 nmol/L，均獲得較好的曲線圖。

2.1.3 敏感性確定:通過重疊PCR合成包含4821-5056 bp區(qū)域EKV-1的G蛋白基因和包含2814-2933區(qū)域的EKV-2的U1蛋白基因，連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，提取質(zhì)粒，測核酸濃度，計算拷貝數(shù)。10倍系列稀釋質(zhì)粒，作為模板PCR，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)計算，EKV-1和EKV-2病毒的實時熒光定量PCR的最低檢出限分別為41拷貝/μl，70拷貝/μl。

2.1.4 可重復(fù)性: 為了了解EKV-1和EKV-2病毒qPCR的穩(wěn)定性，將上述兩種質(zhì)粒10倍稀釋。每種質(zhì)粒各稀釋3個濃度，每個濃度重復(fù)3次，Ct均值分別為15.22、19.10、23.21；16.91、20.64、25.02；標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.136、0.031、0.155；0.294、0.295、0.286；經(jīng)計算變異系數(shù)(CV)分別為1.27%、0.20%、0.82%；2.12%、1.74%、1.40%。顯示該方法的重復(fù)性較好。

表1 EKV-1和EKV-2的引物和探針

2.2伊科普瑪病毒核酸檢測提取報送入境人員的全血和血清標(biāo)本的病毒核酸，使用建立的EKV-1和EKV-2 qRT-PCR方法檢測。結(jié)果顯示該份標(biāo)本EKV-1病毒核酸陰性，EKV-2病毒核酸檢測陽性(全血Ct值24.08，血清Ct值34.68)，顯示全血中的病毒核酸濃度高于血清，而陰性對照標(biāo)本為陰性，再次確定該入境人員的血中攜帶EKV-2病毒核酸。

3 討論

本研究通過建立的實時熒光定量EKV-1和EKV-2 PCR檢測方法，開展中國首例疑似攜帶伊科普瑪病毒的樣本(全血樣本1份，血清1份)的復(fù)核檢測。該樣本通過高通量測序初步檢測出2型伊科普瑪病毒基因，經(jīng)本研究建立的EKV-2 PCR確診送檢樣本含有2型伊科普瑪病毒基因，而EKV-1 PCR檢測方法未檢出，說明建立的qPCR檢測方法可靠性，具有較好的特異性。本研究發(fā)現(xiàn)全血中的病毒核酸拷貝數(shù)高于血清，提示該病毒可能在全血細胞中能夠較好的復(fù)制。

本研究建立了兩種型別伊科普瑪病毒的實時熒光定量PCR檢測方法，陽性標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)的靈敏度較高，EKV-1和EKV-2的最低檢測下限分別為41拷貝/μl和70拷貝/μl，重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。為了更好的評價兩種方法，需要采集更多的陽性樣本或采用模擬樣本(可通過假病毒制備)進行敏感性、特異性評價。

伊科普瑪病毒首次報道于2015年3月[4]。當(dāng)時，美國研究小組在尼日利亞東南部地區(qū)進行不明原因急性發(fā)熱病例調(diào)查，通過二代測序技術(shù)在作為對照組的健康人群血液中偶然發(fā)現(xiàn)兩個不同于已知病原的新基因序列，并完成全長約12 kb的基因組序列測定(在尼日利亞的正常人群中發(fā)現(xiàn)了伊科普瑪病毒)，分別命名為EVK-1和EVK-2(2名健康人來自尼日利亞伊科普瑪村)[4]。兩個新病毒之間差異較大，結(jié)構(gòu)基因的氨基酸同源性小于40%；病毒進化分析顯示，EVK-1與泰布羅加根病毒親緣關(guān)系最近；EKV-2與下剛果病毒親緣關(guān)系最近。該研究小組進一步開展血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，尼日利亞東南部地區(qū)健康人群普遍感染伊科普瑪病毒，EKV-1血清抗體陽性率達10%，EKV-2血清抗體陽性率達50%[4]。研究提示當(dāng)?shù)厝巳焊腥疽量破宅敳《竞芷毡?，但未發(fā)現(xiàn)該病毒對人類具有致病性，推測該病毒對人類可能是無癥狀感染狀態(tài)。

目前，全球尚未成功分離到伊科普瑪病毒。本研究使用BHK細胞、Vero細胞、以及雞胚接種和乳鼠接種尚未分離出病毒。

[1] Longdon B, Murray GG, Palmer WJ, et al. The evolution, diversity, and host associations of rhabdoviruses[J]. Virus Evol, 2015, 1(1): vev014. doi: 10.1093/ve/vev014.

[2] Ralf G. Dietzgena, Hideki Kondob, Michael M. Goodinc,The family Rhabdoviridae: mono- and bipartite negative-sense RNA viruses with diverse genome organization and common evolutionary origins[J]. Virus Res,2017,227(1):158-170.doi: 10.1016/j.virusres.2016.10.010.

[3] Grard G, Fair JN, Lee D,et al. A Novel Rhabdovirus Associated with Acute Hemorrhagic Fever in Central Africa[J]. PLoS Pathog. 2016, 12(3):e1005503.doi: 10.1371/journal.

[4] Matthew H. Stremlau, Kristian G. Andersen, Onikepe A. Folarin, Discovery of Novel Rhabdoviruses in the Blood of Healthy Individuals from West Africa[J]. PLOS Negl Trop Dis.2015,9(3):e0003631. doi: 10.1371/journal.pntd.0003631.

2017-07-04)

(本文編輯：唐瀏英)

Establishmentofareal-timePCRmethodtoidentifyEkpomavirusgeneinbloodsampleofareturneefromAngola

XiaDong,SongJuan,LuoXiaonuan,SongQinqin,WangXinling,WuGuizhen,HanJun

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

HanJun,Email:hanjun_sci@163.com.；SongJuan,Email:helen831020@126.com

ObjectiveTo establish quantitative real-time PCR (qPCR) method based on Taqman probe for detecting Ekpoma virus (EKV).MethodsAccording to the conserved region of gene in EKV genome from GenBank，primers and probe for qPCR were designed. Validity and sensitivity were evaluated in this study. Both whole blood and serum of a returnee from Angola were tested by the established EKV-1 and EKV-2 qPCR method .ResultsSensitivity of EKV-1 and EKV-2 qPCR method was respectively 41 copies/μl and 70 copies/μl. Coefficient of variance (CV) was respectively 1.27%, 0.20%,0.82%；2.12%,1.74%,and 1.40%. EKV-2 gene was detected in both whole blood and serum of a returnee from Angola.ConclusionsThe first EKV-2 gene was confirmed in both whole blood and serum of a returnee from Angola by real-time RT-PCR..

Ekpoma virus; Quantitative real-time polymerase chain reaction

韓俊，Email： hanjun_sci@163.com宋娟，Email：helen831020@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.017

伊科普瑪病毒；實時熒光定量PCR

傳染病重大專項(2013ZX10004-101, 2012ZX10004401, 2013ZX10004805);衛(wèi)生行業(yè)專項課題(201302006);傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室課題(2011SKLID104)

FundprogramsChina Mega-Project for Infectious Disease (2011ZX10004-001, 2012ZX10004401, and 2013ZX10004805), Special Fund for Health-scientific Research in the Public Interest (201302006), SKLID Development Grant (2011SKLID104)