翁育偉 王金章 張擁軍 歐劍鳴 洪榮濤 官升燦 林仲 韓麗豐 鄭奎城 王靈嵐 嚴延生

350001 福州，福建省疾病預防控制中心 福建省人獸共患病重點實驗室(翁育偉、王金章、張擁軍、歐劍鳴、洪榮濤、林仲、鄭奎城、王靈嵐、嚴延生)；350025 福州，福建醫(yī)科大學附屬孟超肝膽醫(yī)院(官升燦、韓麗豐)

·病毒病診斷與治療·

2016年福建省輸入性黃熱病的分子診斷

翁育偉 王金章 張擁軍 歐劍鳴 洪榮濤 官升燦 林仲 韓麗豐 鄭奎城 王靈嵐 嚴延生

350001 福州，福建省疾病預防控制中心 福建省人獸共患病重點實驗室(翁育偉、王金章、張擁軍、歐劍鳴、洪榮濤、林仲、鄭奎城、王靈嵐、嚴延生)；350025 福州，福建醫(yī)科大學附屬孟超肝膽醫(yī)院(官升燦、韓麗豐)

目的應用分子檢測方法，對輸入性黃熱病病例進行實驗診斷。方法采集病例血清和尿液標本，應用實時熒光定量逆轉錄PCR(Real-time RT-PCR)法檢測黃熱病毒特異性核酸；套式RT-PCR法擴增病毒基因片段，序列測定或片段長度多態(tài)性法鑒別野毒株或疫苗株。結果Real-time RT-PCR法檢測5例黃熱病毒核酸陽性病例，病毒在尿液標本中存在時間較血清中存在時間更長，序列測定及限制性片段長度多態(tài)性法證實Angola71型病毒感染。結論同時采用血液和尿液檢測可以提高黃熱病檢測敏感性，RFLP分析方法可快速鑒別野病毒感染，排除因疫苗接種后可能出現(xiàn)的陽性結果。

黃熱病(Yellow fever，YF)是由黃熱病毒(Yellow fever virus，YFV)引起的、經(jīng)蚊媒傳播的急性傳染病[1]，主要表現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、黃疸、肌肉痛、惡心、嘔吐以及疲勞等。少數(shù)病例可發(fā)生嚴重的系統(tǒng)性感染，導致出血和多臟器衰竭，其中約半數(shù)病例死亡[2]。

表15例輸入性YF病例人口學、旅行史、疫苗接種史及臨床特征

Tab.1Demography, travel and immunization history, clinical manifestation and medical examination of five imported cases of YF

特征Characteristics病例Case12345人口學 Demography性別Gender女Female男Male女Female女Female男Male年齡(歲)Age(Year)4242365318旅行暴露及疫苗接種史Historyoftravel，mosquitoexposeandvaccination赴安哥拉日期DatetoAngola2015?32015?92011?32015?12015?9入境日期Dateofarrival2016?03?122016?03?192016?03?212016?03?212016?03?26媒介叮咬Mosquitobiting有Yes有Yes有Yes有Yes有Yes是否接種Vaccination有Yes有Yes有Yes有Yes有Yes接種日期Dateofvaccination2016?03?072016?03?102011?03?092016?03?122016?03?16接種地Addressofvaccination安哥拉Angola安哥拉Angola中國China安哥拉Angola安哥拉Angola病程(日期)Illnesscourse(Date)發(fā)病日期Illnessonset2016?03?112016?03?172016?03?152016?03?132016?03?12首診日期Firstvisithospital2016?03?142016?03?202016?03?232016?03?252016?03?28住院(隔離)日期Hospitalization(Quarantine)2016?03?182016?03?202016?03?232016?03?252016?03?29首次采樣日期Firstsampling2016?03?142016?03?202016?03?242016?03?252016?03?28出院日期Convalescence2016?04?022016?04?162016?04?092016?04?092016?04?09臨床癥狀Clinicalsigns發(fā)熱Fever有Yes有Yes有Yes有Yes有Yes頭痛Headache有Yes有Yes無No有Yes有Yes關節(jié)痛Arthralgia無No有Yes無No無No有Yes黃疸Jaundice無No無No無No無No無No惡心Nausea無No是Yes無No無No無No嘔吐Vomit無No是Yes無No無No無No血液學檢查Hematologicalexamination白細胞Leukocyte(10E9cells/L)5 52 210 35 86 5血小板Platelet(10E9cells/L)204106320266373中性粒比率Ratioofneutrophils(%)51 061 472 145 253 1凝血功能Coagulation正常Normal正常Normal異常Abnormal異常Abnormal正常Normal生化檢查Chemicalexamination總膽紅數(shù)Totalbilirubin(μmol/L)155 419 1NANA丙氨酸氨基轉移酶Alaninetransaminase(Unit/L)81127513978259天冬氨酸轉氨酶Aspartateaminotransferase(Unit/L)491295756061γ谷氨?；D移酶γ?gultamyltransferase(Unit/L)11992121NA177

注：血液和生化檢查結果為病例在定點醫(yī)院隔離期間檢查結果。NA：未知

Note：The hematological and chemical examinations were performed during the time patients quarantined in designated hospital. NA: not available

YFV屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirusgenus)成員。根據(jù)病毒的進化關系以及地域分布，YFV至少可以分為7種基因型[3-5]。其中基因II型Asibi株已用于制備疫苗并使用幾十年[6]。YFV感染可導致病毒血癥，因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦使用病例血清標本作為病毒核酸檢測材料，并以此作為病例診斷依據(jù)之一[7-8]。然而，YFV感染者病毒血癥期相對較短，僅能維持十天左右。同時有報道表明，減毒活疫苗接種同樣可能導致病毒血癥，因此在應用核酸檢測方法開展實驗室診斷過程中，對檢測結果判定應十分謹慎[9]。本研究應用常規(guī)RT-PCR、基因測序、限制性片段長度多態(tài)性(Restrictive fragment length polymorphism，RFLP)等方法，從2016年自安哥拉回國的人員中血液和尿液標本中檢測出Angola-71型YFV，為病例的及時診斷和實施預防控制提供了可靠依據(jù)。

1 材料與方法

表2rRT-PCR法從不同標本中檢測YFV核酸的檢出時間

Tab.2Specimens, time-point of sampling, and nucleotide acid detection of YFV by real time RT-PCR method

病例Case標本Sample采樣時間(發(fā)病后，天)#Intervaltimesbetweenillnessonsetandsampling(days)123456789101112131415161718192021221血清Sera++??尿液UreaNSNS++2血清Sera++??尿液UreaNS+++3血清Sera??尿液Urea++4血清Sera??尿液Urea++5血清Sera???尿液Urea+++

注： 陽性和陰性檢測結果分別以+/-表示；NS表示未采樣。

Note： The plus and minus symbols denoted to the positive and negative of nucleotide acid detection respectively. NS: not sampled

各序列來源：17D vaccine(北京天壇)擴增和測序結果，Angola為Genbank下載(AY968064)，Case1-3為病例1-3標本的擴增和測序結果。圖內(nèi)方框表示SmaI內(nèi)切酶位點圖1 YF病例與疫苗株216擴增片段的序列比較The sequences of 17D vaccine strain and the viruses from case 1-3 were sequenced in this study, and that of Agola strain (AY968064) downloaded from Genbank. The frame in aligned sequences indicated the Smal I siteFig.1 Comparison of YFV sequences of 216bp fragment from YF cases and vaccine strain

1.1病例信息、臨床數(shù)據(jù)和標本病例人口學、旅行史和免疫史等資料均通過現(xiàn)場流行病學調(diào)查獲得；病例的臨床、生化檢測等結果來自福建醫(yī)科大學附屬孟超肝膽醫(yī)院(YF定點收治醫(yī)院)病案資料(見表1)。病例首次標本(血清或尿液)于病例入境后首診當日或次日(病例3)采集，病例發(fā)病與首次采樣時間間隔分別為3、3、9、12、16 d(見表2)。首次標本采集后，間隔不同天數(shù)繼續(xù)采集患者血清和尿液標本。所有標本采集后，均于-4 ℃條件下送至福建省疾病預防控制中心檢測。標本采集均獲得患者知情同意 ，本研究通過福建醫(yī)科大學附屬孟超肝膽醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.2試劑病毒核酸提取試劑QIAamp viral RNA mini kit及一步法通用Real time RT-PCR(rRT-PCR)試劑均購置Qiagen公司，一步法RT-PCR試劑以及Bigdye 3.1 cycling sequencing測序試劑均采購自Life technologies公司，其他試劑為實驗室常規(guī)試劑。中國疾病預防控制中心提供常規(guī)實時RT-PCR引物和探針。黃病毒屬通用引物[10-11](MA：5′-CATGATGGGRAARAGRGARRAG-3′，cFD2：5′-GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC-3′)由上海生工合成。黃熱病17D減毒活疫苗購自天壇生物有限公司。

1.3實時熒光RT-PCR病毒RNA提取按試劑操作說明，特異性rRT-PCR擴增體系包括無RNase去離子水5.25 μl、2×反應體系混合物12.5 μl、正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μl、探針(10 μmol/L) 0.25 μl、酶混合物1 μl、病毒RNA模板5 μl。反應條件為50 ℃ 30 min; 95 ℃ 10 min; 94 ℃ 15 s、 60 ℃ 45 s，共45個循環(huán)。CT值小于等于35判為陽性。

1.4病毒基因片段的擴增和測序采用反轉錄套式RT-PCR擴增部分病毒基因片段，第一輪反應體系包括無RNase去離子水32 μl、10×RT-PCR緩沖液5 μl、dNTP (10 mmol/L) 2 μl、MA 和 cFD2 引物 (10 μmol/L)各2 μl、酶混合液2 μl、RNA 模板5 μl。反應條件為：50 ℃ 30 min; 95 ℃ 15 min; 94 ℃ 1 min、53 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。第二輪反應條件為去離子水31 μl、10×反應緩沖液5 μl、dNTP (2.5 mmol/L each) 4 μl、ExTaq 聚合酶 (TaKaRa) 1 μl, MA和cFD2引物(10 μmol/L) 各2 μl，最后加入5 μl 40倍稀釋的第一輪產(chǎn)物為模板。反應條件為：95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s、53 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30 循環(huán);72 ℃延伸5 min。取40 μl 套式反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后純化，使用Bigdye 3.1 試劑盒(Life Technologies)及MA與cFD2 引物，按說明書操作，ABI3500 測序儀測序。

1.5RFLP在病毒序列比較基礎上，應用RFLP法進行病毒野生株和疫苗株的快速鑒別。取反轉錄套式RT-PCR反應產(chǎn)物10 μl，加入10×SmaI限制性內(nèi)切酶緩沖液1.5 μl，去離子水2.5 μl，SmaI(10 U/μl)1 μl，37 ℃消化30 min后，2%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結果

2.1實時RT-PCR檢測在首次采集的血液和尿液標本中，有2例血液標本檢測陽性，3例尿液標本檢測陽性。持續(xù)采樣檢測結果顯示，尿液標本中的病毒存在時間較血液中更長。在所有采集的標本中，血液中病毒存在時間最長為發(fā)病后8 d(病例1)，而尿液中病毒存在時間最長為發(fā)病后22 d(病例5)。不同病例的采樣時間、樣本類型及檢測結果見表2。

2.2病毒基因片段擴增及測序應用黃病毒屬通用引物MA和cFD2，從所有病例的血清或尿液標本中均擴增出261 bp片段。病例1-3擴增產(chǎn)物的測序結果表明，病毒核酸序列的一致性為100%，見圖1。與GenBank中序列比對結果表明，與片段序列最為相似的病毒為YFV Angola-71株(序列號：AY968064)，序列一致性為98%。

2.3RFLP分析病例1-3標本擴增的片段序列與17D疫苗株序列比較發(fā)現(xiàn)，3例輸入性病例感染的病毒序列中存在SmaI內(nèi)切酶位點(圖1)，而在17D疫苗株及其衍生株(17DD、17D-204、17D-213等)的對應序列中，均未發(fā)現(xiàn)該位點。采用SmaI內(nèi)切酶對病例4尿液中擴增的產(chǎn)物進行了酶切消化，可見該擴增片段可被酶切成大小約為140 bp 和 121 bp兩個片段，病例5擴增產(chǎn)物酶切結果與此類似，而對應的17D疫苗株則無法被該內(nèi)切酶消化。

3 討論

YFV感染后可產(chǎn)生病毒血癥，因此WHO推薦采用血清標本作為實驗室診斷材料[9]。然而在該起境外輸入YF病例疫情事件中，應用實時rRT-PCR法，本研究只能從2例發(fā)病1周內(nèi)的病例血清標本中檢出病毒特異性核酸，其他3例發(fā)病超過1周的病例血清樣本檢測結果則為陰性。以往曾有自疫苗接種者尿液中檢出病毒核酸的報道[12]，因此，本研究嘗試利用病例的尿液標本作為檢測材料，結果表明，3例血清檢測陰性病例以及2例血清檢測陽性的病例尿液中均可檢出病毒特異性核酸，并且病毒在尿液中檢出的時間可長達22 d(病例5)。此結果提示，在YFV感染的實驗室檢測中，除了可應用血清標本外，還可使用尿液作為檢測材料，并且后者可檢出病毒的時間較前者更長。

YF是一種法定報告的國際衛(wèi)生檢疫傳染病，境外YF病例輸入是重大公共衛(wèi)生事件，因此對實驗室檢測結果的判讀必需十分謹慎。在該起疫情中，所有病例的臨床表現(xiàn)均較輕微，未見有明顯的內(nèi)臟或神經(jīng)系統(tǒng)損傷，且病例均有疫苗接種史(表1)。為排除疫苗接種后可能出現(xiàn)的接種副反應[10-11,13]，同時排除因疫苗接種后，血液等檢材中存在疫苗株病毒而出現(xiàn)的假陽性結果，本研究擴增了病毒部分基因片段進行測序分析，并利用序列分析結果發(fā)展RFLP方法，證明了該起疫情系Angola-71樣病毒感染引起，從而為后續(xù)可能輸入的病例提供了快速、可靠的檢測方法，并顯著提高了檢測時效。

本次疫情確診的5例YF病例中，有4例系在安哥拉黃熱病暴發(fā)疫情發(fā)生期間，因居住地周邊出現(xiàn)病例，擔心感染而在發(fā)病1周前后曾接種疫苗。疫苗接種后感染野生型YFV的原因推測與疫苗接種時間較短有關，一般認為，YF疫苗接種后1周左右產(chǎn)生IgM抗體，約兩周左右才能產(chǎn)生中和抗體。而上述病例在安哥拉期間，居住周邊環(huán)境條件普遍較差，均有蚊蟲叮咬史，因此推測病例在疫苗接種前后感染YFV，而在此階段，病例雖接種疫苗，但體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體水平尚不足以提供有效保護。

17D YFV減毒活疫苗是最有效的疫苗之一。單劑次接種即可提供終身的免疫保護而無需加強免疫[14]。疫苗接種失敗的案例極為罕見。然而，值得注意的是，在本次疫情中，1例病例(病例3)在發(fā)病前5年即接種過17D疫苗(2011年3月9日)，并能追溯到接種記錄。根據(jù)WHO的立場文件[15]，導致YFV疫苗接種失敗的因素包括接種時妊娠、HIV感染以及營養(yǎng)不良等。根據(jù)流行病學調(diào)查以及實驗室檢測，本研究排除該病例HIV感染和營養(yǎng)不良的可能；但回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病例接種時正處于妊娠期，因此推測，該病例發(fā)生野生型YFV感染的原因可能系妊娠導致疫苗接種失敗所致。此現(xiàn)象提示，在今后疫苗接種過程中，需詳細了解病例的接種適應癥，避免導致可能的接種失敗或嚴重不良反應。

此次疫情系國內(nèi)首次境外YF輸入事件。由于埃及伊蚊等YF傳播媒介在中國分布廣泛，同時有些地區(qū)存在大量的免疫空白人群，因此有理由擔心輸入性病例可能導致在國內(nèi)的傳播擴散。在不斷增長的國內(nèi)外交流和經(jīng)濟來往日益密切的今天，為有效預防控制YF等蟲媒病毒病的輸入以及可能導致的本土擴散，亟需加強病例監(jiān)測、出入境檢疫、媒介控制等防控措施。

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2017-06-04)

(本文編輯：唐瀏英)

MoleculardiagnosisofyellowfeverimportedintoFujianprovince,2016

WengYuwei,WangJinzhang,ZhangYongjun,OuJianming,HongRongtao,GuanShengcan,LinZhong,HanLifeng,ZhengKuicheng,WangLinglan,YanYansheng

FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,FujianProvincialKeyLaboratoryofZoonosis,Fuzhou350001,China(WengYW,WangJZ,ZhangYJ,OuJM，HongRT,LinZ,ZhengKC,WangLL,YanYS)；FuzhouMengchaoHepatobiliaryHospitalofFujianMedicalUniversity.Fuzhou350025,China(GuanSC,HanLF)

WengYuwei,Email:wengywfjcdc@aliyun.com

ObjectiveTo make laboratorial diagnosis of imported yellow fever (YF) cases in Fujian province with molecular method .MethodsSerum and urine samples were collected from suspected cases at various time-points post illness onset. Real-time RT-PCR and nested RT-PCR were performed respectively for viral specific nucleotide detection and fragment amplification. Sequencing and restrictive fragment length polymorphism (RFLP) method were used to identify the wild virus infection.ResultsA total of five cases with wild yellow fever virus (YFV) infection were confirmed in this study. It revealed that the viral agent belonged to Angola-71 like YFV, and the duration of viral agent in urine was longer than that in serum.ConclusionsSimultaneous detection of serum and urine samples would increase detection sensitivity, and further RFLP method contributed to rapid identification of wild YFV infection and exclusion of positive result due to recent vaccination.

Yellow fever; Imported case; Molecular diagnosis; Vaccine

翁育偉，Email: wengywfjcdc@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.014

黃熱?。徊±?輸入性；分子診斷；疫苗

國家高技術研究發(fā)展計劃(2011AA02A114)；國家重大科技專項(2012ZX10004-210-003)；福建省醫(yī)學創(chuàng)新課題(2015-CXB-13)

FundprogramsNational Hi-tech Research and Development Project (2011AA02A114)；National Major Scientific and Technological Project (2012ZX10004-210-003)；Fujian Provincial Medical Innovation Project (2015-CXB-13)