劉文彥 亞白柳△ 王桂斌 陳俊如

（1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，濟(jì)寧272067；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，濟(jì)寧272067）

尾核內(nèi)催產(chǎn)素對(duì)痛閾的調(diào)制作用及其機(jī)制研究

劉文彥1亞白柳1△王桂斌2陳俊如2

（1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，濟(jì)寧272067；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，濟(jì)寧272067）

目的：探討大鼠尾核內(nèi)催產(chǎn)素(oxytocin, OT)在痛行為調(diào)制中的作用，及其與內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)之間的關(guān)系。方法：用WQ-9E型鉀離子透入痛閾測(cè)量?jī)x測(cè)痛。以引起大鼠甩尾反應(yīng)的最小電流強(qiáng)度(mA)作為痛行為反應(yīng)值，將間隔1 min的3次痛行為反應(yīng)值的平均值作為一次痛閾，每間隔10 min測(cè)定痛閾一次，取給藥前的兩次痛閾的平均值作為基礎(chǔ)痛閾，給藥后各次的痛閾與其相比，計(jì)算痛閾變化的百分?jǐn)?shù)(%)。實(shí)驗(yàn)分三部分進(jìn)行，第一部分觀察尾核內(nèi)注射OT對(duì)大鼠痛行為的影響；第二部分觀察尾核內(nèi)注射抗催產(chǎn)素血清(anti-OT serum, AOTS)對(duì)大鼠痛行為的影響；第三部分觀察尾核內(nèi)注射納洛酮(Naloxone, Nx)對(duì)OT在痛行為中作用的影響。結(jié)果：尾核內(nèi)注入OT后，大鼠的痛閾明顯增加，并在一定范圍內(nèi)呈明確的劑量-效應(yīng)關(guān)系；向尾核內(nèi)注入AOTS以中和內(nèi)源性O(shè)T后，大鼠痛閾有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；向尾核內(nèi)注入Nx后，不能完全阻斷OT在痛行為反應(yīng)中的作用。結(jié)論：尾核內(nèi)OT參與大鼠痛行為調(diào)制的復(fù)雜過(guò)程，引起痛行為反應(yīng)的閾值增加，此作用不完全依賴于內(nèi)源性的阿片肽系統(tǒng)。

尾核；催產(chǎn)素；抗催產(chǎn)素血清；納洛酮；痛閾

有資料表明，側(cè)腦室和脊髓蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)注射催產(chǎn)素 (oxytocin, OT) 能明顯提高大鼠痛行為反應(yīng)的閾值和增強(qiáng)電針鎮(zhèn)痛的效應(yīng)，注射抗催產(chǎn)素血清(anti-OT serum, AOTS) 對(duì)大鼠痛行為反應(yīng)的閾值雖無(wú)明顯影響，但能顯著降低電針鎮(zhèn)痛效應(yīng)[1,2]。進(jìn)一步的工作還表明，腦內(nèi)的甲硫氨酸腦啡肽、亮氨酸腦啡肽以及β-內(nèi)啡肽均不影響OT的此種作用，而腦內(nèi)強(qiáng)啡肽對(duì)OT在電針鎮(zhèn)痛中的效應(yīng)有一定的對(duì)抗作用[3]。提示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的OT在痛行為調(diào)制的復(fù)雜過(guò)程中發(fā)揮著一定作用，并且此作用不依賴于腦內(nèi)的內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)。尾核 (caudate nucleus, CN) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)痛行為調(diào)制的重要部位，含有OT、OT神經(jīng)末梢及OT受體[4]，尾核內(nèi)OT是否參與痛行為的調(diào)制以及機(jī)制如何是人們極為關(guān)注的問(wèn)題。本工作通過(guò)向尾核內(nèi)注入OT、AOTS以及納洛酮(Naloxone, Nx)，觀察了尾核內(nèi)OT對(duì)大鼠痛行為反應(yīng)的影響，探討了尾核內(nèi)OT在痛行為調(diào)制中的作用以及與內(nèi)源性阿片肽之間的關(guān)系。旨在豐富腦內(nèi)神經(jīng)肽對(duì)痛行為調(diào)制的認(rèn)識(shí)，為OT的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)資料。

方 法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康wistar雄性大鼠，體重230～300 g，實(shí)驗(yàn)前在研究室內(nèi)分籠飼養(yǎng)1周，給予充足的飲水和飼料。用戊巴比妥鈉 (35 mg/kg) 麻醉后，把動(dòng)物固定于江灣I-C型腦立體定位儀上，根據(jù)L.J.Pellegrino鼠腦定向圖譜，按座標(biāo)A2.0、LR2.5、H5.0定位尾核，埋置外徑0.6 mm的不銹鋼導(dǎo)管，用“502”膠水和牙科水泥固定。術(shù)后3～5天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。注射藥物時(shí)將不銹鋼注射管插入導(dǎo)管內(nèi)，尖端伸出管外1 mm，向雙側(cè)尾核內(nèi)各注射0.5 μl的藥液，3 min注射完畢。

2.實(shí)驗(yàn)藥品

催產(chǎn)素為美國(guó)Peninsula Lab產(chǎn)品，納洛酮為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)前均用生理鹽水 (NS) 配成所需濃度?？勾弋a(chǎn)素血清AOTS為第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室制備，效價(jià)1:15 000，與β-內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽A、甲-腦啡肽、神經(jīng)降壓素及精氨酸加壓素等多肽在濃度為2～4096 pg/管時(shí)均無(wú)交叉反應(yīng)。

3.實(shí)驗(yàn)分組

（1）尾核內(nèi)注射OT對(duì)大鼠痛行為的影響：本部分實(shí)驗(yàn)分為5組。①生理鹽水組(NS)；②1ng催產(chǎn)素組 (1 ngOT)；③2 ng催產(chǎn)素組 (2 ngOT)；④4 ng催產(chǎn)素組 (4 ngOT)；⑤8 ng催產(chǎn)素組 (8 ngOT)。

（2）尾核內(nèi)注射AOTS對(duì)大鼠痛行為的影響：本部分實(shí)驗(yàn)分為2組。①正常兔血清組(NRS)；②抗催產(chǎn)素血清組(AOTS)。

（3）尾核內(nèi)注射Nx對(duì)OT在痛行為中作用的影響：本部分實(shí)驗(yàn)分為3組。①生理鹽水組 (NS)；②納洛酮-生理鹽水組 (Nx-NS)；③納洛酮-催產(chǎn)素組 (Nx-OT)。

4.痛閾測(cè)定

將大鼠放置在特制的鼠固定器中[1]，30 min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。用WQ-9E型鉀離子透入痛閾測(cè)量?jī)x測(cè)痛，無(wú)關(guān)電極置于右側(cè)后肢，測(cè)痛電極置于鼠尾(距尾根部2.5 cm處)。以引起甩尾反應(yīng)的最小電流強(qiáng)度 (mA)為痛行為反應(yīng)值，將間隔1 min的3次痛行為反應(yīng)值的平均值作為一次痛閾，每間隔10 min測(cè)定痛閾一次，取給藥前的兩次痛閾的平均值作為基礎(chǔ)痛閾 (pain threshold, PT)，給藥后各次的痛閾與其相比，計(jì)算痛閾變化的百分?jǐn)?shù)(%)。

5.組織定位

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，向尾核內(nèi)注入等量的氨基黑B10，隨后灌流、取腦、固定和切片，光鏡下定位。凡位點(diǎn)偏離尾核者，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果均棄之不用。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，在對(duì)痛閾變化率的數(shù)據(jù)進(jìn)行平方根反正弦變換后，用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析比較兩組間差異的顯著性。OT劑量與痛閾變化率之間的相關(guān)性用相關(guān)系數(shù)(r)作為指標(biāo)，判斷其顯著性。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.尾核內(nèi)注射OT對(duì)大鼠痛行為的影響

大鼠測(cè)定基礎(chǔ)痛閾后，向雙側(cè)尾核內(nèi)各注入2 ngOT后10 min，痛閾增加 (21.13±5.80)%，20 min時(shí)增加 (33.18±10.15)%達(dá)到頂點(diǎn)，隨后逐漸降低，在注藥后50 min內(nèi)，與注入NS (NS組)相比，痛閾有明顯增加(P＜ 0.05)。

向雙側(cè)尾核內(nèi)分別各注入1 ngOT、2 ngOT、4 ngOT和8 ngOT后10 min，大鼠痛閾較注藥前分別 增 加(6.81±8.66)%、(21.13±5.80)%、(40.32± 14.90)%和 (66.15±14.18)%，與注入NS相比，痛閾有明顯增加；OT劑量與痛閾變化率之間具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜ 0.05)。在此劑量范圍內(nèi)，注藥后20 min、30 min、40 min和50 min時(shí)，OT劑量與痛閾變化率之間也均有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P＜ 0.05，見(jiàn)圖1)。

圖1 尾核內(nèi)注射OT 對(duì)大鼠痛閾的影響(±SD) *P ＜ 0.05，與NS組相比Fig.1 Effect of caudate nucleus injection of OT on painthreshold modulation in rat (±SD) *P ＜ 0.05, compared with NS group.

2.尾核內(nèi)注射AOTS對(duì)大鼠痛行為的影響

大鼠測(cè)定基礎(chǔ)痛閾后，向雙側(cè)尾核內(nèi)各注入AOTS 0.5 μl（AOTS組）后60 min內(nèi)，痛閾較注藥前降低，與注入正常兔血清(NRS組)后痛閾變化相比，AOTS 組痛閾有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)圖2)。

圖2 尾核內(nèi)注射AOTS 對(duì)大鼠痛閾的影響(n=6,±SD) *P ＜ 0.05，與NS組相比Fig.2 Effect of caudate nucleus injection of AOTS on pain thr-eshold modulation in rat (n=6,±SD) *P ＜ 0.05, compared with NS group.

3.尾核內(nèi)注射Nx對(duì)OT在痛行為中作用的影響

大鼠測(cè)定基礎(chǔ)痛閾后，向雙側(cè)尾核內(nèi)各注入5 μg Nx(Nx-NS組)后10 min，痛閾降低(-11.29± 7.65)%，40 min時(shí)降低 (-31.26±11.56)%達(dá)到最低點(diǎn)，與注入NS (NS組) 相比，注藥后痛閾有明顯降低(P＜ 0.05)。向雙側(cè)尾核內(nèi)各注入5 μg Nx后立即再注入2 ngOT (Nx-OT組)，在注藥后60 min內(nèi)痛閾變化，與Nx-NS組相比，有明顯增加(P＜ 0.05，見(jiàn)圖3)。

圖3 尾核內(nèi)注射納洛酮對(duì)OT在+痛閾中作用的影響(±SD) *P ＜ 0.05，與NS 組相比；P ＜ 0.05，與Nx-NS 組相比Fig.3 Effect of naloxone on pain threshold modulation by OT incaudate nucleus of rats (±SD)+ *P ＜ 0.05, compared with NS group; P ＜ 0.05, compared with Nx-NS group.

討 論

催產(chǎn)素是在下丘腦視上核和室旁核的大細(xì)胞神經(jīng)元中合成的一種9肽激素，除了使妊娠末期子宮收縮和促進(jìn)授乳期排乳的經(jīng)典作用外，還具有多種生物學(xué)作用，如參與機(jī)體的神經(jīng)內(nèi)分泌、學(xué)習(xí)與記憶、痛覺(jué)調(diào)制、體溫調(diào)節(jié)等[5-8]。有資料顯示，刺激視上核或室旁核后，動(dòng)物痛行為反應(yīng)的閾值明顯增加；而損毀后，動(dòng)物痛行為反應(yīng)的閾值則明顯降低；且腦內(nèi)參與痛行為調(diào)制的內(nèi)源性O(shè)T主要來(lái)源于視上核[9,10]。眾所周知，下丘腦視上核與腦內(nèi)參與痛行為調(diào)制的有關(guān)核團(tuán)，如藍(lán)斑、中縫大核(NRM)、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)、尾核、脊髓背角等均有著極為密切的聯(lián)系，當(dāng)刺激視上核或同時(shí)給予電針時(shí)，這些核團(tuán)內(nèi)OT 的含量發(fā)生顯著變化[11,12]。提示，視上核釋放的OT 可能是通過(guò)這些核團(tuán)的某些成分而發(fā)揮痛行為的調(diào)制作用。

尾核是痛行為調(diào)制的關(guān)鍵部位，其內(nèi)不僅含有多種與痛行為調(diào)制有關(guān)的生物活性物質(zhì)，與其它參與痛行為調(diào)制的中樞結(jié)構(gòu)，如下丘腦、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、中縫大核等也有著極為密切的聯(lián)系，尤其是尾核-PAG-NRM之間的關(guān)系更為引人關(guān)注[13,14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠尾核內(nèi)注入OT后，痛行為反應(yīng)的閾值明顯增加，并且在1 ng～8 ng范圍內(nèi)有著明確的劑量效應(yīng)關(guān)系。為了進(jìn)一步探討內(nèi)源性O(shè)T在生理狀態(tài)下是否參與痛行為調(diào)制，本實(shí)驗(yàn)采用微量注射抗體的方法對(duì)之進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，向尾核內(nèi)注入AOTS以中和內(nèi)源性O(shè)T后，大鼠痛閾有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示，尾核內(nèi)外源性O(shè)T引起大鼠痛行為反應(yīng)的閾值增加，但在生理狀態(tài)下內(nèi)源性O(shè)T在痛行為調(diào)制中究竟發(fā)揮何種作用，尚需進(jìn)一步研究。

內(nèi)源性阿片肽在痛行為調(diào)制中發(fā)揮著重要作用。有資料顯示，電針或尾核內(nèi)微電泳導(dǎo)入阿片激動(dòng)劑可激活尾核細(xì)胞，電刺激尾核頭部可引起痛行為反應(yīng)閾值增加；同時(shí)，PAG中阿片肽的釋放增多，引起NRM神經(jīng)元的放電增多[10]。提示，阿片肽在尾核-PAG-NRM聯(lián)系中起著重要作用。尾核內(nèi)的內(nèi)源性阿片肽與OT在痛行為調(diào)制中的關(guān)系引人關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，向尾核內(nèi)注入大劑量阿片受體拮抗劑Nx后，能明顯減小大鼠痛行為反應(yīng)的閾值，此與以往的文獻(xiàn)報(bào)道相吻合[14]。本實(shí)驗(yàn)還顯示，注入Nx后再注入OT（Nx-OT組），其痛行為反應(yīng)的閾值明顯高于Nx組。提示，當(dāng)尾核內(nèi)阿片受體被封閉后，OT仍能提高大鼠的痛閾，OT在痛行為反應(yīng)調(diào)制中的作用并不完全依賴于內(nèi)源性的阿片肽系統(tǒng)。另外，本實(shí)驗(yàn)尚有一定局限性。受樣本量限制，試驗(yàn)數(shù)據(jù)離散趨勢(shì)較大。在下步實(shí)驗(yàn)中，我們將繼續(xù)加大樣本量，彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)不足。

尾核中除阿片肽系統(tǒng)外，乙酰膽堿、5-羥色胺、多巴胺、一氧化氮等活性物質(zhì)與痛行為的調(diào)制也有著密切的關(guān)系[14～16]，尾核內(nèi)OT參與痛行為調(diào)制的作用與這些生物活性物質(zhì)之間的關(guān)系怎樣，也是饒有興趣的問(wèn)題，正在探討。

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PAIN THRESHOLD MODULATION BY OXYTOCIN IN THE RAT CAUDATE NUCLEUS*

LIU Wen-Yan1, YA Bai-Liu1△, WANG Gui-Bin2, CHEN Jun-Ru2
(1Department of Physiology, Jining Medical College, Jining 272067, China;2School of Clinical Medicine, Jining Medical College, Jining 272067, China)

Objective:To investigate the effect of oxytocin (OT) in the rat caudate nucleus on pain threshold modulation and its relationship with endogenous opioid system.Methods:Potassium iontophoresis was performed to test the effect of pain threshold of rats after injecting OT, anti-oxytocin serum (AOTS) and naloxone (Nx) into the caudate nucleus. The minimal current intensity (mA) in potassium iontophoresis which caused a rat to fl ick its tail was used as the indicator of pain responses. The average value of the pain response indicators, which were detected 3 times with intervals of 1 min, was used as pain threshold. The pain thresholds detection interval was 10 min, and the average of two thresholds before drug administration was used as basic pain threshold. Each of the pain threshold values measured after drug administration was compared with the basic threshold and then the percentage of pain threshold changes (%) was calculated. The experiment included three parts: the fi rst was to observe the effect of OT injection in the caudate nucleus on pain modulation; the second was to observe the effect of AOTS injection in the caudate nucleus on pain modulation; and the third was to observe the effect of NX injection on pain modulation.Results:Administration of OT into the caudate nucleus caused signi fi cant increase of pain threshold of the rats, and showed a clear dose-dependent response in a certain range. The injection of AOTS led to a trend of slight decrease of the pain threshold, but the difference was not statistically signi fi cant. The injection of Nx into the caudate nucleus did not completely block the effect of OT on pain responses.Conclusion:OT in the rat caudate nucleus plays an important role in the complex process of pain modulation and this effect is not entirely dependent on the endogenous opioid system.

Caudate nucleus; Oxytocin; Anti-oxytocin serum; Naloxone; Pain threshold

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.01.006

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.39090336)；山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.Q98C01124)；山東省自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No.ZR2015HQ019)；濟(jì)寧市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012jnjc05)；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院博士基金；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No.CX2016001)；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研課題(2015)

△通訊作者 yabailiu@126.com