李瑤　楊倩　周丹

[摘要] 目的 探討飛揚腸胃炎膠囊的體外抑菌效果。 方法 采用試管二倍稀釋法聯(lián)合瓊脂平板法，以頭孢曲松鈉為陽性對照藥，測定飛揚腸胃炎膠囊對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌、白色念珠菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。 結果 飛揚腸胃炎膠囊對大腸埃希菌（MIC為6.25 mg/mL）、金黃色葡萄球菌（MIC為1.56 mg/mL）、糞腸球菌（MIC為25.00 mg/mL）、銅綠假單胞菌（MIC為6.25 mg/mL）、β-溶血性鏈球菌（MIC為12.50 mg/mL）的體外抑菌作用較強，對白色念珠菌（MIC為100.00 mg/mL）的體外抑菌作用較弱。 結論 飛揚腸胃炎膠囊對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌具有較強的體外抑菌作用。

[關鍵詞] 飛揚腸胃炎膠囊；試管二倍稀釋法；最小抑菌濃度；抑菌作用

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（a）-0021-04

[Abstract] Objective To investigate the antimicrobial activity in vitro of Feiyang Changweiyan Capsules. Methods The tube double dilution method and agar plate method were used to determine the minimum inhibitory concentrations （MIC） and minimum bactericidal concentrations （MBC） of Feiyang Changweiyan Capsules against Escherichia coil， Staphylococcus aureus， Enterococcus faecalis， Pseudomonas aeruginosa， β-hemolytic streptococcus and Candida albicans， taking Ceftriaxone as positive control drug. Results The antibacterial activity of Feiyang Changweiyan Capsules against Escherichia coil （MIC was 6.25 mg/mL）， Staphylococcus aureus （MIC was 1.56 mg/mL）， Enterococcus faecalis （MIC was 25.00 mg/mL）， Pseudomonas aeruginosa （MIC was 6.25 mg/mL） and β-hemolytic streptococcus （MIC was 12.50 mg/mL） was stronger， which of Candida albicans （MIC was 100.00 mg/mL） was weaker. Conclusion Feiyang Changweiyan Capsules have stronger antimicrobial activity in vitro for Escherichia coil， Staphylococcus aureus， Enterococcus faecalis， Pseudomonas aeruginosa and β-hemolytic streptococcus.

[Key words] Feiyang Changweiyan Capsules； Tube double dilution method； Minimum inhibitory concentrations； Antimicrobial activity

飛揚腸胃炎膠囊由飛揚草、火炭母、救必應三味中藥組成，具有瀉火解毒、除濕止痢的功效，臨床上用于細菌性痢疾和急、慢性腸胃炎的治療，療效顯著，副作用小[1]。飛揚草為大戟科大戟屬植物飛揚草（Euphorbia hirta L.）的干燥全草，主要分布于我國南方、日本、印度和亞熱帶地區(qū)[2]。據(jù)報道，飛揚草在印度常用于女性疾病和兒童寄生蟲感染的治療，此外，對呼吸系統(tǒng)疾病、鼻炎、支氣管炎等有良好的作用[3]?，F(xiàn)代研究表明[4-6]，飛揚草乙醇提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的生長有抑制作用，正己烷提取物對小鼠醋酸丙酯引起的炎癥有治療作用?；鹛磕甘寝た浦参锘鹛磕福≒olygonum chinense L.）的藥用全草，臨床上主要用于濕熱泄瀉、痢疾、濕熱瘡疹、霉菌性陰道炎等疾病的治療[7-8]，火炭母的莖和葉提取物對細菌有抑制作用[9]。救必應為冬青科植物鐵冬青（Ilex rotunda Thunb.）的干燥樹皮，常用于乳娥、腹瀉、痢疾的治療[10]。研究表明，救必應的乙醇提部位和蒸餾水提取部位均有較強的抑菌作用[11]。雖然關于飛揚草、火炭母、救必應三個單味藥的抗菌抗炎作用以及其他藥理研究較多，但對此三味藥組方而成的飛揚腸胃炎膠囊的抗菌抗炎作用研究較少，所以本研究選取6種常見致病菌，測定飛揚腸胃炎膠囊的體外抑菌作用，為探討該藥作用機制及進一步擴大適應證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸埃希菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213）、糞腸球菌（ATCC29212）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、β-溶血性鏈球菌（臨床菌株）、白色念珠菌（ATCC 90028）均由第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院微生物檢驗科提供。

1.2 藥物

飛揚腸胃炎膠囊（陜西君碧莎制藥有限公司，批準文號：國藥準字Z20080523）；注射用頭孢曲松鈉（上海羅氏制藥，批號：SH6101）。endprint

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基干粉（英國OXOID公司，批號：201603291）；血瓊脂培養(yǎng)基（英國OXOID公司，批號20160114B）。

1.4 儀器與設備

MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋），Centrifuge 5418R小型冷凍高速離心機（德國艾本德公司），BSC-1360ⅡB2生物安全柜（HDL公司），微量加樣器（吉爾森公司），BSA224S賽多利斯分析天平（德國賽多利斯公司），HF212UV CO2培養(yǎng)箱（上海力康），麥氏比濁儀（法國梅里埃）。

1.5 供試品藥液的配制

稱取10 g飛揚腸胃炎膠囊內(nèi)容物，加適量蒸餾水（16倍）回流提取90 min，抽慮，濾液蒸干得樣品1。稱取10 g飛揚腸胃炎膠囊內(nèi)容物，加適量75%乙醇（16倍）回流提取90 min，抽慮，濾液蒸干得樣品2。

分別稱取3.0 g樣品1和樣品2，加入15 mL無菌生理鹽水，待完全溶解后，12 000 r/min，r = 7.7 cm，離心10 min，吸取上清液過0.22 μm無菌濾膜，即得濃度為200 mg/mL的樣品1和樣品2原藥液。

精密稱取對照藥2.56 mg注射用頭孢曲松鈉干粉，加10 mL無菌生理鹽水溶解，即得濃度為256 mg/L的原藥液。

1.6 菌液的制備

用無菌接種環(huán)將凍存的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌、白色念珠菌以三段劃線法接種于無菌血瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)35℃恒溫培養(yǎng)24 h后，采用麥氏比濁法，用生理鹽水校正各菌液濃度至0.5麥氏比濁標準（即1.5×108 CFU/mL）待用。

1.7 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定

按照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）2007標準，采用試管二倍稀釋法測定藥物MIC[12-13]。每個菌種的抑菌實驗取滅菌試管2排，每排11管，每管加入1 mL滅菌營養(yǎng)肉湯，分別在第1管中加入1 mL樣品1原液和樣品2原液，混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，連續(xù)倍比稀釋至第9管，到第9管時棄去1 mL，此時各管藥物濃度依次為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.781 25、0.390 625 mg/mL，此外，在β-溶血性鏈球菌的兩排試管中分別加入無菌脫纖羊血100 μL。然后每管中分別加入調整好的各菌株稀釋液10 μL，使每管最終菌液濃度為105 CFU/mL。因真菌比細菌大，故真菌最終濃度約為104 CFU/mL。第10管為無菌陰性對照，第11管為無藥陽性對照。同樣取12只滅菌試管排成一排，每管加入1 mL滅菌營養(yǎng)肉湯，在第1管中加入對照品原液1 mL混勻，其余操作同上，各管藥物濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L，第11管為無菌陰性對照，第12管為無藥陽性對照。樣品1、樣品2和陽性藥物MIC測定分別重復3次，以3次數(shù)值相同為最終結果。

因中藥本身顏色較深以及人的視覺差異，需采用瓊脂平板法轉板來確定其MBC值，以提高對藥物抑菌作用判定的準確性。在判定完藥物對應菌的MIC值后，從MIC值所對應藥物濃度及以上的試管中分別用無菌接種環(huán)取10 μL培養(yǎng)物，采用平板劃線法將培養(yǎng)物接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，置35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后觀察平板上是否有菌落生長，以不生長菌落的最高藥物稀釋濃度為飛揚腸胃炎膠囊對該菌的MBC。

2 結果

2.1 飛揚腸胃炎膠囊不同溶劑提取物及注射用頭孢曲松鈉對6種菌的效力

陰性對照組中無菌的液體培養(yǎng)基和平板均無菌生長，陽性對照組試管有菌生長，出現(xiàn)渾濁，同時劃平板培養(yǎng)的菌落生長良好，且本研究所測得的注射用頭孢曲松鈉值與CLSI的參考值以及文獻報道注射用頭孢曲松鈉MIC值[14]進行對比，可知，本研究結果有效。見表1。

2.2 飛揚腸胃炎膠囊對6種常見菌的MIC

飛揚腸胃炎膠囊水提取物對大腸埃希菌和β-溶血性鏈球菌的抑菌作用更好，飛揚腸胃炎膠囊醇提取物對大腸埃希菌和β-溶血性鏈球菌的抑制作用比水提取物稍弱，飛揚腸胃炎膠囊水提物和醇提物對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的抑菌效力相當。見表2。

2.3 飛揚腸胃炎膠囊對6種常見菌的MBC

飛揚腸胃炎膠囊水提物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌的抑菌作用相當，飛揚腸胃炎膠囊醇提物對大腸埃希菌的殺菌作用稍弱于水提物。對比飛揚腸胃炎膠囊不同提取物的MIC值和MBC值可知，MBC值比MIC值濃度高2～4個梯度。見表3。

綜合分析以上結果，飛揚腸胃炎膠囊對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌及糞腸球菌有較強的抑菌作用，對白色念珠菌的抑菌作用較弱。

3 討論

飛揚腸胃炎膠囊由飛揚草、火炭母、救必應三味中藥組方而成，其中君藥飛揚草可清熱解毒利濕，祛除腸道濕熱邪氣，臣藥火炭母可增強飛揚草的解毒利濕功效，佐使藥輔助飛揚草和火炭母利濕解毒之功，止痛功效可改善腹痛癥狀。

人體作為一個生命整體，其局部微生態(tài)是人生命環(huán)境的一部分，微生物群之間是有聯(lián)系的，有學者認為人體的腸道和陰道的微生態(tài)平衡存在著相互調節(jié)的作用[14]。婦科炎癥和腸胃炎的發(fā)生與陰道微生物群和腸道微生物群的紊亂有關[15-18]，飛揚腸胃炎膠囊又有應用于女性疾病治療的歷史，結合飛揚腸胃炎膠囊組方中三味藥物良好的抑菌作用，本研究選擇了引起婦科炎癥的6種常見致病菌，進行飛揚腸胃炎膠囊的體外抑菌實驗研究，通過體外抑菌實驗初步確定飛揚腸胃炎膠囊對婦科炎癥常見菌的作用。實驗結果表明，飛揚腸胃炎膠囊對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、β-溶血性鏈球菌及糞腸球菌抑制作用較強，對白色念珠菌抑制作用較弱。根據(jù)體外研究結果，筆者下一步會繼續(xù)進行體內(nèi)動物實驗研究，探討飛揚腸胃炎膠囊對婦科炎癥的治療作用，為擴大飛揚腸胃炎膠囊適應證研究提供理論依據(jù)。endprint

由于中草藥提取液本身顏色較深，且中藥制劑的一大特點是“藥輔合一”，即選擇制劑處方中的某些藥味既作為藥物又作為輔料，減少其他輔料的用量[19]，這就使得中成藥溶解后會出現(xiàn)顏色較深且渾濁的現(xiàn)象，影響體外抑菌實驗終點的判斷。

本研究對藥物進行前期處理，按照藥物原制備工藝，分別選擇蒸餾水和75%乙醇對飛揚腸胃炎膠囊進行重新提取，得到澄清度較高的原藥液，再結合瓊脂平板法測定MBC，提高了飛揚腸胃炎膠囊體外抑菌效果判斷的準確性。本研究中采用重新提取除去輔料并結合平板法能減少中藥顏色對結果判斷造成的影響，得出的結果可靠，因此，此方法可以為以后中藥類制劑的體外抑菌實驗方法提供參考。實驗中選擇注射用頭孢曲松鈉作為陽性對照藥，因為現(xiàn)有國內(nèi)測定中藥類MIC值并沒有標準的MIC值參考，也沒有統(tǒng)一的MIC實驗室測定標準，選擇注射用頭孢曲松鈉注射液作為陽性對照藥，測定的MIC值與美國臨床和實驗室標準協(xié)會及文獻報道注射用頭孢曲松鈉MIC值[20]進行對比，可確定本研究操作方法和條件符合要求，測出的MIC值有參考價值。

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（收稿日期：2017-06-04 本文編輯：張瑜杰）endprint