蘇 強， 趙 晗， 崔百會， 宋冰雪， 宗成文

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

篤斯越桔rbcL基因克隆與系統(tǒng)發(fā)育分析

蘇 強， 趙 晗， 崔百會， 宋冰雪， 宗成文*

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

以汪清縣蘭家林場采集的篤斯越桔葉片為樣本，采用PCR方法擴增rbcL基因，分析rbcL序列在篤斯越桔及其近緣植物的序列差異，分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果表明：克隆得到的篤斯越桔rbcL基因片段長599 bp，編碼199個氨基酸殘基。核苷酸多序列比對發(fā)現(xiàn)，篤斯越桔與歐洲越桔和小葉越桔在第68和390堿基位置有差異，并從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中得出篤斯越桔和卵葉越桔首先聚為一類，說明篤斯越桔和卵葉越桔親緣關(guān)系更近。

篤斯越桔；rbcL基因；序列分析；系統(tǒng)發(fā)育

篤斯越桔 (Vacciniumuliginosum)是杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(Vaccinium)多年生落葉灌木, 一般高度為50～80 cm，果實為藍紫色小漿果[1]。越桔果實中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，花青素是其中大量存在的一種黃烷醇類多酚類化合物[2]，具有抗氧化、抗炎癥、促進視紫紅質(zhì)合成、提高免疫力、抗癌等多種生理功能，具有很高的開發(fā)利用價值[2-5]。

DNA條形碼(DNA barcoding)是根據(jù)生物的遺傳物質(zhì)序列種內(nèi)變異小于種間變異而實現(xiàn)物種鑒定的一種方法[4]。rbcL基因不具有內(nèi)含子，位于葉綠體基因組的大單拷貝區(qū)，以單拷貝形式存在，已經(jīng)被廣泛應用在綠色植物的系統(tǒng)進化研究中[5]，它具有2種功能，可以催化2種反應：分別是羧化反應和加氧反應[6]。同時迄今為止，已經(jīng)測定了被子植物、裸子植物、苔蘚、海藻、光合細菌等多種不同材料中的rbcL基因序列[7]。

近年來由于過度采摘等原因，群落的破壞日趨嚴重，篤斯越桔野生資源的合理開發(fā)與保護利用等越來越受到人們的重視。該實驗室前期研究表明，長白山篤斯越桔種質(zhì)資源具有在果實大小、果實形狀、葉片形狀、花色、果皮厚度、株高等具有較高的遺傳多樣性，但關(guān)于用植物DNA條形碼研究篤斯越桔遺傳進化的研究尚未見報道。本研究對克隆出的rbcL基因片段，利用多序列比對技術(shù)分析樣本與GenBank中越桔屬植物其它樣本的序列差異，并進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和遺傳距離分析，旨在為篤斯越桔的遺傳多樣性和遺傳進化進一步研究奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1材料

試驗所用的材料從汪清蘭家林場野外采集，經(jīng)度E 130°53′54″，緯度N 43°25′37″，海拔高度850 m，收集當年生新鮮嫩葉，經(jīng)變色硅膠快速干燥后帶回實驗室內(nèi)-20 ℃低溫保存，備用。

1.2主要試劑

凝膠回收試劑盒(購自北京華越洋公司)，dNTP mixture、10×Buffer、rTaq DNA 聚合酶、pMD18-T載體試劑盒和大腸桿菌DH5α等均購自Takara(大連)工程有限公司，引物，由北京三博遠志生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1 DNA提取

使用華越洋植物DNA提取試劑盒，以保存的篤斯越桔葉片為材料提取總DNA，步驟按試劑盒中使用說明書進行，檢測合格后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 篤斯越桔rbcL基因的PCR擴增

擴增rbcL序列所用引物正向為 5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’，反向為 5’-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3’[8]。PCR 反應體系為25 μL：2.5 μL 10×PCR 緩沖液，1 μL dNTP，0.2 μL rTaq 酶，上游和下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，去離子水18.3 μL。擴增程序為 95 ℃預變性 5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后延伸 5 min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.3.3 篤斯越桔rbcL基因的克隆鑒定和測序

利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，并與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞[9]，送北京三博遠志生物工程有限公司進行測序。所有步驟均按說明書進行。

1.3.4 篤斯越桔rbcL基因的序列分析

NCBI在線BLAST對篤斯越桔的rbcL基因序列進行比對，并下載越桔屬的相關(guān)序列(表1)，采用Clustal X 1.83[10]軟件分別進行多序列比對，用GeneDoc[11]軟件輸出比對結(jié)果，采用Mega5.1[12]軟件構(gòu)建越桔屬內(nèi)基于rbcL基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行遺傳距離分析。

表1 來源于GenBank的越桔屬rbcL序列

2 結(jié)果與分析

2.1篤斯越桔rbcL基因PCR擴增和克隆測序結(jié)果

以提取的篤斯越桔基因組DNA為模板，利用rbcLF和rbcLR引物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測[13]，在500～750 bp處出現(xiàn)單一清晰明亮的擴增條帶(圖1)，與GeneBank中查閱到的其它地區(qū)篤斯越桔登錄號分別為(KX677950)和(JN966056)的rbcL基因片段大小均在500～750 bp內(nèi)。

回收該條帶并進行克隆[14]，送生物公司測序，結(jié)果顯示，獲得了長度為599 bp的篤斯越桔rbcL基因序列，核苷酸序列及所編碼的氨基酸序信息如圖2所示，共編碼了199個氨基酸序列。

圖1 篤斯越桔rbcL PCR電泳檢測結(jié)果

2.2篤斯越桔rbcL基因的多序列比對及遺傳距離分析

2.2.1 篤斯越桔rbcL基因的多序列比對

經(jīng)BLAST[15]核苷酸序列比對，發(fā)現(xiàn)本試驗中篤斯越桔rbcL基因，與GeneBank[16]中報道登錄號為AF421107、KX677950、JN966056的越桔屬植物篤斯越桔核苷酸序列一致性達到100%，且GeneBank中報道的篤斯越桔rbcL序列只有這3個，與登錄號為KM361028和HF572812的歐洲越桔、登錄號為L12625蔓越桔、登錄號為KX678178和JN966057的紅豆越桔、登錄號為KX679271、KX678990、KX678940的小葉越桔、登錄號為KX678497和KX678426的卵葉越桔核苷酸序列一致性均達到99%，與登錄號為AF419837的紅豆越桔核苷酸序列一致性達到98%，說明本試驗成功地克隆了篤斯越桔rbcL基因，序列比對結(jié)果如圖3所示。

圖2 篤斯越桔rbcL基因及編碼的氨基酸序列

從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，樣本序列與紅豆越桔、蔓越橘、卵葉越桔在第68個堿基位置都是堿基C，而歐洲越桔和小葉越桔在第68個堿基位置都是堿基A，還發(fā)現(xiàn)篤斯越桔rbcL序列與紅豆越桔、蔓越橘、卵葉越桔在第390個堿基位置都是堿基G，而歐洲越桔和小葉越桔在第390個堿基位置都是堿基A，因為本試驗克隆的只是篤斯越桔rbcL基因部分的DNA序列，所以這2處堿基上的差異還需要進一步探究。

圖3 樣本序列與越桔屬rbcL核苷酸序列多序列比對結(jié)果

2.2.2 篤斯越桔與GeneBank中越桔屬植物遺傳距離分析

采用p-distance[17]法計算遺傳距離，結(jié)果由表2可見，遺傳距離變幅為0.000～0.013，平均遺傳距離為0.004。統(tǒng)計表明，105個遺傳距離中，有46個大于平均遺傳距離，且差異很小，篤斯越桔與14個越桔屬樣本之間的遺傳變異幅度較小，且多數(shù)低于平均遺傳距離，表明越桔屬植物之間遺傳差異較小。

表2 基于rbcL序列的越桔屬各樣本遺傳距離

2.3篤斯越桔rbcL基因的系統(tǒng)進化分析

利用MEGA5.1軟件生成系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，對篤斯越桔與下載其他越桔屬植物的rbcL基因同源區(qū)域的序列進行比對和系統(tǒng)進化分析[18]，結(jié)果顯示，來自越桔屬的篤斯越桔和卵葉越桔首先與本試驗樣本聚合，然后與歐洲越桔和小葉越桔聚合，最后與紅豆越桔聚為一類，說明卵葉越桔與篤斯越桔親緣關(guān)系更近。

圖4 基于rbcL序列的越桔屬樣本NJ系統(tǒng)樹

3 討論與結(jié)論

DNA條形碼作為一種新的分類系統(tǒng)，能夠有效地完善傳統(tǒng)進化和分類方法的不足之處，推進全球生物物種系統(tǒng)進化和鑒定的快速發(fā)展，其自Hebert于2003年提出后，已經(jīng)應用于動物、植物、真菌和藻類等的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中。在植物研究中，RbcL,MatK和ITS是最近使用最普遍的DNA條形碼候選序列，但對不同植物科、屬或種內(nèi)還需要進行針對性的研究和探索[19]。到目前為止，rbcl序列已應用于許多分類群的系統(tǒng)發(fā)育研究中，從科內(nèi)(多為遠緣屬間)到有花植物主要譜系間[20]，甚至是在整個蕨類植物中[21]，以及種子植物譜系間的關(guān)系[22]。季紅春等[23]關(guān)于珙桐的rbcL基因分析結(jié)果表明，珙桐編碼區(qū)氨基酸與煙草、菠菜、玉米、甘薯、擬南芥、水稻、葡萄、地錢和葡萄柚等9個物種的氨基酸同源一致性超過94.13%，其結(jié)果還表明，rbcL基因不能用于識別全部物種，但能夠用來區(qū)分許多同屬植物。劉曉慶等[24]關(guān)于大豆rbcL基因序列的研究發(fā)現(xiàn)，大豆與其他10個物種rbcL基因的核苷酸的同源一致性在85.37%～95.31%，氨基酸的同源一致性在90.87%～96.47%。這表明rbcL基因在核苷酸和氨基酸水平上都具有高度的保守性和同源性，且氨基酸的同源一致性高于核苷酸。本試驗通過對篤斯越橘rbcL序列與GeneBank中的14中越桔屬植物的多序列比對發(fā)現(xiàn)，篤斯越桔rbcL基因與歐洲越劇和小葉越桔在第68和390堿基位置有序列差異，而在這2個位置與紅豆越桔、蔓越橘、卵葉越桔沒有序列差異，關(guān)于篤斯越桔與歐洲越桔和小葉越桔在第68和390堿基位置的差異是否可以用于它們之間的物種鑒定還需要進一步探究，國內(nèi)關(guān)于篤斯越桔rbcL基因還未見報道，本試驗旨在為關(guān)于篤斯越桔遺傳進化研究奠定基礎。

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CloningandphylogeneticanalysisofrbcLgeneofVacciniumuliginosum

SU Qiang, ZHAO Han, CUI Baihui, SONG Bingxue, ZONG Chengwen*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Leaves of theVacciniumuliginosumcollected from Wangqing Lanjia forest as materials, therbcLgene was cloned by PCR, and its sequence and phylogenetic relationships in comparison withrbcLsequences from relatedVacciniumplants were analyzed. The results, showed that the length of DNA fragment ofrbcLgene fromVacciniumuliginosumwas 599bp, encoding a peptide fragment comprising of 199 amino acids. The nucleotide sequence isolated here involved two single base differences at the 68th and 390th bases compared the DNA sequences ofrbcLgene fromVacciniummyrtillusandVacciniumparvifolium, respectively. By DNA sequence alignment,Vacciniumuliginosumand Vaccinium ovatum was clustered into the same class in the phylogenetic tree, indicating that theVacciniumuliginosumwas more closely related with Vaccinium ovatum.

Vaccinium uliginosum ;rbcLgene ; sequence analysis ; phylogenetic

2017-06-20

國家自然科學基金項目(31460504)；吉林省科技支撐計劃重點項目(20120251)

蘇強(1991—)，男，吉林四平人，在讀碩士，研究方向為果樹生物技術(shù)。宗成文為通信作者，

E-mail:zongchengwen@aliyun.com

1004-7999(2017)03-0007-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.002

S722.32

A