吳 鑫， 黃杰濤， 張蓮姬

(延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000)

苯酚-硫酸法測定榛花多糖含量分析條件的優(yōu)化

吳 鑫， 黃杰濤， 張蓮姬*

(延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000)

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，通過單因素和L9(34)正交試驗(yàn)，優(yōu)化苯酚-硫酸法測定榛花多糖含量的顯色條件，并對該法的精密度、加標(biāo)回收率等進(jìn)行研究。結(jié)果表明：最佳顯色條件是濃硫酸5.0 mL， 5%苯酚0.6 mL，顯色溫度30 ℃，顯色時間40 min。在此條件下，平均回收率為99.34%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)0.35%。優(yōu)化后的苯酚-硫酸法是測定榛花多糖含量的一種穩(wěn)定性好、回收率高的簡便方法。

榛花；多糖；苯酚-硫酸法

榛是一種被子植物，分布在我國22個省(區(qū))，生長迅速，資源很豐富。榛花為榛樹的雄花，具有消炎、消腫及止痛作用，可用于皮膚炎癥、凍傷等，是一味民間沿用歷史悠久的藥用植物[1-2]。國內(nèi)外對榛花的研究始于2001年，南征等首次報(bào)道了榛花具有解毒、降血糖作用[3]。在此基礎(chǔ)上蔡英蘭等進(jìn)行了更系統(tǒng)的榛花對四氧嘧啶性糖尿病小鼠的降糖作用的實(shí)驗(yàn)研究，并初步探討了其降糖機(jī)理[4-5]。其后的研究報(bào)道表明,榛花總黃酮、榛花有機(jī)溶劑提取物和水提取物都具有很好的抗氧化能力[6-13]。但目前為止關(guān)于榛花多糖的研究尚未見報(bào)道。

多糖含量對于評價(jià)一種多糖產(chǎn)品具有重要的意義，是其進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的重要前提，因此,對多糖含量測定的準(zhǔn)確性有了更高的要求，多糖含量測定方法的研究具有重要的意義[14-18]。目前檢測多糖含量的方法主要有高效液相色譜法和比色法，前者因高純度的多糖對照品難以獲得等因素的制約而較少使用，而后者作為測量多糖的經(jīng)典方法，不需要大型儀器，操作簡單易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在多糖的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。苯酚-硫酸比色法是測定多糖含量的傳統(tǒng)方法而被廣泛應(yīng)用[19-23]。其測定原理是在濃硫酸的作用下將多糖水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，該物質(zhì)與苯酚反應(yīng)生成橙黃色化合物，在波長490 nm附近處和一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度與糖濃度呈線性關(guān)系。但苯酚-硫酸法存在一定的波動性，不同的含多糖類物質(zhì)測定條件均有所不同，如果只參考已有文獻(xiàn)的測定條件來確定具體的試驗(yàn)參數(shù)將可能造成較大的誤差。為此，本研究在選擇濃硫酸用量、苯酚用量、顯色時間和顯色溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)優(yōu)化苯酚-硫酸法測定榛花多糖含量的顯色條件，并對該方法的穩(wěn)定性、精密度、回收率等進(jìn)行研究，得出榛花多糖含量的最佳測定條件。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1) 材料：榛花采集于吉林省長白山，曬干后粉碎，過60目篩，備用。

2) 試劑：無水乙醇、石油醚、濃硫酸、三氯乙酸、苯酚、葡萄糖均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市科析儀器有限公司)；U-3010紫外分光光度計(jì)(日本日立公司)；8-20 型多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3方法

1.3.1 溶液的配制

1) 榛花粗多糖供試液的配制：將一定量干燥的榛花粉，置于索氏提取器裝置中，分別以無水乙醚和無水乙醇處理至回流液的顏色接近無色，揮干溶劑后置于60 ℃烘箱中烘干。準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理的榛花粉1 000 g，加入30 mL蒸餾水，在80 ℃水浴條件下浸提2次，每次2 h，3 500 r/min離心20 min，取上清液用去離子水定容至1 000 mL，即得榛花粗多糖供試液。

2) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g，用蒸餾水定容至100 mL，配制成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，即得濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3) 5%苯酚溶液的配制:取苯酚75.0 g，加0.1 g鋁片和0.05 g 無水碳酸鈉，蒸餾收集182 ℃餾分，稱取此餾分25.0 g 置于500 mL的容量瓶中，加蒸餾水溶解定容，搖勻后置于棕色瓶中，放入冰箱避光保存，備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

分別考察濃硫酸用量、苯酚用量、顯色溫度和顯色時間對490 nm處[24]榛花多糖顯色后吸光度的影響，平行做3次。

1.3.3 L9(34)正文試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上以吸光度為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，每組作3個平行試驗(yàn)，取平均值，得出苯酚-硫酸法測定榛花多糖含量的最佳顯色條件。因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 因素水平表

1.3.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取1 mL 20、40、60、80、100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液，取1 mL去離子水為空白對照，按1.3.3確定的最佳顯色條件，于490 nm處測吸光度，以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

1.3.5 精密度試驗(yàn)

吸取榛花多糖供試液1.0 mL，按1.3.3確定的最佳顯色條件，于490 nm處測吸光度，平行測定5次，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，并分析其重現(xiàn)性。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取榛花多糖供試液1.0 mL，按1.3.3確定的最佳顯色條件，于490 nm處每隔一定時間測吸光度。

1.3.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

分別吸取榛花多糖供試液1.0 mL 3份于50 mL錐形瓶中，按1.3.3確定的最佳測定條件，于490 nm處測吸光度。另取3份榛花多糖溶液1.0 mL于50 mL錐形瓶中，分別加入1.0 mL濃度不同的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3確定的最佳顯色條件，于490 nm處測吸光度，并計(jì)算加標(biāo)回收率。

回收率=(加標(biāo)試樣測定值-試樣測定值)/加標(biāo)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1 濃硫酸用量對吸光度的影響

由圖1可知，隨著濃硫酸加入量的增加，溶液的吸光度呈先升高后減少的趨勢，當(dāng)濃硫酸的加入量為5.0 mL時，吸光度值達(dá)到最高值，繼續(xù)增加濃硫酸用量會使吸光度值下降，因此，選擇5.0 mL濃硫酸為最佳用量。

圖1 不同濃硫酸用量的吸光度比較

2.1.2 苯酚用量對吸光度的影響

由圖2可知，5%苯酚加入量為0.6 mL時，吸光度達(dá)到最高值，繼續(xù)增大苯酚用量，吸光度值有明顯的下降，因此,選擇0.6 mL為最佳5%苯酚用量。

圖2 不同苯酚用量的吸光度比較

2.1.3 顯色時間對吸光度的影響

由圖3可知，隨著顯色時間從20增加到30 min時,吸光度也增加，顯色時間為30 min時吸光度最大，再增加顯色時間時吸光度又緩慢減少，其原因可能是時間過長，多糖結(jié)構(gòu)部分受到破壞，從而導(dǎo)致吸光度的降低[25]。因此,選擇最佳的顯色時間為30 min。

圖3 不同顯色時間的吸光度比較

2.1.4 顯色溫度對吸光度的影響

由圖4可知，不同顯色溫度對吸光度值有明顯的影響，當(dāng)顯色溫度為30 ℃時，吸光度達(dá)到最高值，其后吸光度下降，超過50 ℃后下降更明顯，因此,選擇顯色溫度為30 ℃。

圖4 不同顯色溫度的吸光度比較

2.2正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)濃硫酸用量、苯酚用量、顯色時間、顯色溫度水平表(表1)，采用L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化苯酚-硫酸法測定榛花多糖含量的顯色條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，硫酸用量對吸光度的影響最大，是影響測定多糖含量的最主要因素；各因素對吸光度的影響大小順序是：硫酸用量>苯酚用量>顯色溫度>顯色時間；且測定榛花多糖含量的最佳因素組合是A2B2C3D2，而試驗(yàn)測定結(jié)果中，吸光度最大的組合為A2B2C3D1，因此,對這2組進(jìn)行比較試驗(yàn)，其結(jié)果見表3。

表3 試驗(yàn)組的吸光度比較結(jié)果

由表3可知，A2B2C3D2組合優(yōu)于A2B2C3D1, 所以最佳測定條件為A2B2C3D2, 即濃硫酸5 mL，5%苯酚0.6 mL，顯色時間40 min，顯色溫度30 ℃。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，葡萄糖為20 ～120 μg/mL時,其濃度與吸光度線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y =0.010 49 x-0.055 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4精密度試驗(yàn)

吸取榛花粗多糖供試液1 mL，在最優(yōu)測定條件下平行測定5次，計(jì)算RSD值為0.68%，表明重現(xiàn)性良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表4可知，榛花多糖樣品液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，隨著時間的增加，吸光度值略有下降，尤其在前60 min內(nèi)吸光度值由最初0. 620只降至0.609,120 min時降至0.597，相對平均偏差RSD為0.50%。

表4 穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.6加標(biāo)回收率試驗(yàn)

由表5可知，該實(shí)驗(yàn)方法的平均回收率為99.34%，RSD為0.35%，表明該測定方法準(zhǔn)確率高。

表5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)分析結(jié)果可以看出，在苯酚-硫酸法測定榛花多糖過程中，各因素的影響順序?yàn)榱蛩嵊昧?苯酚用量>顯色溫度>顯色時間。苯酚-硫酸法中顯色的最佳條件為濃硫酸5.0 mL，5%苯酚0.6 mL，顯色溫度30 ℃，顯色時間40 min。在最優(yōu)條件下測定的平均回收率為99.34%，RSD為0.35%，顯色液在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，表明該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好，快速簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于榛花多糖含量的定量測定。

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Optimizationofanalyticalconditionsforthedeterminationofpolysaccharidecontentinhazelnutbyphenolsulfuricacidmethod

WU Xin， HUANG Jietao, ZHANG Lianji

(YanbianUniversity,YanjiJilin133000,China)

With glucose as standard, through the single factor and L9(34) orthogonal experiment, the phenol sulfuric acid method to determine the polysaccharide content of Hazel's flower color conditions was optimized, and the precision of the method and its recovery rate were studied. The results showed that the best color condition was 490nm, the concentration of concentrated sulfuric acid was 5.0 mL, the content of phenol was 5% 0.6 mL, the color temperature was 30 ℃, and the color time was 40 min. Under these conditions, the average recovery was 99.34%, and the relative standard deviation (RSD) was about 0.35%. The phenol-sulfuric acid method optimized was a simple method to detect Hazel's flower polysaccharide content with high stability and high recovery rate.

hazelnut flower; polysaccharide; phenol-sulfuric acid method

2017-01-11

延邊大學(xué)2016年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(ydbksky2016102)

吳鑫(1995—)，男，山西運(yùn)城人，在讀學(xué)士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的提取。張蓮姬為通信作者，

E-mail：736313515@qq.com

1004-7999(2017)03-0044-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.008

R284

A