李 賀， 姜 君， 蔣曉龍， 劉冠甫, 廉美蘭, 樸炫春

(延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002 )

東北刺人參不定根對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞促炎介質(zhì)的影響

李 賀， 姜 君， 蔣曉龍， 劉冠甫, 廉美蘭, 樸炫春*

(延邊大學(xué)長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002 )

東北刺人參是五加科兼具觀賞和藥用價(jià)值的珍貴瀕危植物。為了促進(jìn)東北刺人參產(chǎn)品的開發(fā)，在抗炎相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)中以不定根代替短缺的野生植株作為植物材料。該研究利用誘導(dǎo)子未處理和處理的生物反應(yīng)器培養(yǎng)的東北刺人參不定根水提物處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，通過檢測(cè)巨噬細(xì)胞中一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子-(TNF-)及白細(xì)胞介素-1(IL-1)3種促炎介質(zhì)的水平，探明不定根的抗炎活性。研究表明：2種東北刺人參不定根提取物中總酚和總黃酮含量有很大差異，誘導(dǎo)子處理的不定根水提物(E 2)中總酚含量是誘導(dǎo)子未處理不定根水提物(E 1)的3.2倍，而總黃酮含量是2.7倍。2種不定根提取物對(duì)NO和TNF-及IL-1的影響不同，E2對(duì)3種促炎介質(zhì)均有顯著的抑制作用，但E1只抑制NO的生成，對(duì)TNF-及IL-1沒有影響，E2的抗炎效果高于E1。因此，今后在進(jìn)行抗炎相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)中，可利用在生物反應(yīng)器培養(yǎng)中經(jīng)誘導(dǎo)子處理的東北刺人參不定根作為原材料。

不定根；誘導(dǎo)子；巨噬細(xì)胞；促炎介質(zhì)

東北刺人參(OplopanaxelatusNakai)又名刺參，五加科多年生落葉灌木，屬于國家二級(jí)保護(hù)植物，是兼具觀賞和藥用價(jià)值的珍貴植物[1]。東北刺人參分布區(qū)域較狹窄，國內(nèi)主要分布于吉林省長(zhǎng)白地區(qū)，國外僅在朝鮮和俄羅斯有少量分布[2]。東北刺人參具有極高的藥用功效，對(duì)神經(jīng)衰弱、低血糖、糖尿病、心血管病、風(fēng)濕等疾病有一定療效，并具有抗氧化、抗真菌、抗炎和抗癌[3-5]等作用。然而，近年來東北刺人參野生資源遭到嚴(yán)重破壞，且人工栽培體系尚未建立，植物材料嚴(yán)重短缺，因此，對(duì)東北刺人參的活性及其成分分離等方面研究的開展面臨困難，導(dǎo)致產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)也受到限制。針對(duì)這些問題，采用植物細(xì)胞培養(yǎng)工程手段，將培養(yǎng)的細(xì)胞、組織或器官作為新植物材料源應(yīng)用于產(chǎn)品生產(chǎn)中具有重要意義。目前，利用生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)植物細(xì)胞生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的技術(shù)受到越來越多的關(guān)注，已報(bào)道的有貫葉連翹[6]、紫錐菊[7]等多種植物。東北刺人參的不定根生物反應(yīng)器的培養(yǎng)方法方面，我們團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了研究報(bào)道[8-9]。與其他生物活性研究受限一樣，目前尚無東北刺人參抗炎方面的研究報(bào)道。因此，該研究利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)的東北刺人參不定根提取物處理小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，通過檢測(cè)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一氧化氮(NO)和腫瘤壞死因子-(TNF-)及白細(xì)胞介素-1(IL-1)等促炎介質(zhì)水平，初步探明東北不定根的抗炎活性，為今后東北刺人參抗炎特性和機(jī)制研究及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

按李慧娟等[10]的方法用東北刺人參無菌播種苗誘導(dǎo)并增殖不定根。

1.2藥品

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美國)、青霉素、鏈霉素和3-(4,5-二甲基噻唑-2 ) -2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Sigma公司，美國)，IL-1β抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)，脂多糖(LPS)和ATP(Invivogen公司，美國)，茉莉酸甲酯(Sigma，美國)，沒食子酸(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，中國)和蘆丁(北京索萊寶科技有限公司，中國)。其余試劑均為市售分析純。

1.3儀器

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(UV-2600，日本島津公司，日本)，蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)印設(shè)備(Bio-Rad公司，美國)，凝膠成像儀(LAS-3000，F(xiàn)ujifilm公司，日本)。

1.4動(dòng)物

8周齡體重為(22±4) g的C57BL/6雌性小鼠，購于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證編號(hào)為SCXK(吉) -2011-0004。試驗(yàn)前，將小鼠置于25 ℃，相對(duì)濕度(50±5)%的環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，給予食物并自由飲水。試驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.5方法

1.5.1 不定根提取物的制備及其總酚和總黃酮含量的測(cè)定

將東北刺人參不定根切成約1 cm大小后，接種至5 L氣升式反應(yīng)器中，接種量為5 g/L。反應(yīng)器中加入4 L培養(yǎng)基不定根增殖生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MS+IBA 3 mg/L+蔗糖50 g/L，pH值5.8)，通入75 mL/min的氣體，在溫度約為25 ℃的條件下暗培養(yǎng)。不定根在反應(yīng)器中培養(yǎng)30 d后，以茉莉酸甲酯(200M)作為誘導(dǎo)子，用濾膜(0.45m)濾菌后加入到培養(yǎng)基中處理8 d，培養(yǎng)天數(shù)共38 d的不定根和未加入茉莉酸甲酯培養(yǎng)38 d后收獲的不定根放置于45 ℃恒溫箱中烘干至恒重。將烘干的不定根樣品磨碎后，取15 g浸泡在200 mL的蒸餾水中超聲1 h后過濾，將收集的濾渣重復(fù)超聲2次，3次濾液合并后，45 ℃下進(jìn)行真空減壓干燥(R206，上海慎科學(xué)技術(shù)有限公司，中國上海)，得到誘導(dǎo)子處理(E 1)和未處理(E 2)的兩種不定根提取物，放置于4 ℃下貯藏，備用。

將不定根提取物用70%乙醇溶解，并稀釋5 000倍后，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品利用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)760 nm處測(cè)定總酚含量，而總黃酮含量以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品在510 nm處測(cè)定。

1.5.2 巨噬細(xì)胞的獲取

C57BL/6小鼠腹腔注射4%的2 mL巰基醋酸鹽培養(yǎng)液，4 d后獲得腹膜滲出細(xì)胞。將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS和抗生素(100 U/mL 青霉素和100g/mL 鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，過夜后去除上清液，獲得巰基醋酸鹽誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞。

1.5.3 不定根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響

將巨噬細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞密度為8×104個(gè)。將2種不定根提取物E 1和E 2用二甲基亞砜(DMSO)溶解后，配置成25、50、100和200g/mL 4種不同濃度后處理巨噬細(xì)胞，孵育8 h后棄去培養(yǎng)基，并在每孔加入含有MTT(500g/mL)的DMEM培養(yǎng)基100L，在37 ℃和5%CO2下孵育4 h，棄去培養(yǎng)基。之后，每孔加DMSO溶解甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)550處測(cè)吸收度，檢測(cè)提取物的細(xì)胞毒性，確定進(jìn)一步抗炎活性試驗(yàn)中的提取物濃度。

1.5.4 促炎介質(zhì)水平的測(cè)定

將巨噬細(xì)胞接種于48孔板中，每孔的細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)，并于培養(yǎng)箱(37 ℃和5%CO2)中孵育12 h后，將培養(yǎng)基棄掉，加入25、50和100g/mL的不定根提取物，未用提取物處理的加入DMEM培養(yǎng)基做為空白和對(duì)照組，孵育1 h后，提取物處理組和對(duì)照組中加入0.1g/mL LPS，空白組不加LPS。為了測(cè)定促炎介質(zhì)NO的釋放量，在LPS刺激24 h后，取細(xì)胞上清液，采用Griess還原法于酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光值(OD)。促炎因子TNF-α的釋放量于LPS刺激6 h后，取細(xì)胞上清液，利用ELISA試劑盒，按照說明書操作，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定。

為了測(cè)定促炎因子IL-1β蛋白水平，在48孔板中每孔加入2.5×105個(gè)巨噬細(xì)胞后，于37 ℃和5% CO2下孵育12 h，棄培養(yǎng)基，加入0.1g/mL LPS刺激3 h后，加入不同濃度的不定根提取物處理1 h，再加入5 mM ATP處理1 h后，離心取上清液。蛋白質(zhì)經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離后，用300 mA電流將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉1 h，并用IL-1β抗體(1∶1 000，4 ℃)中孵育過夜。最后，與HRP標(biāo)記的二抗(1∶ 5 000，室溫)進(jìn)行反應(yīng)，并用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影(LAS-3000)。

1.5.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用Graphpad Prism 5軟件程序，采用t測(cè)驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1不定根提取物中總酚及總黃酮的含量

利用生物反應(yīng)器進(jìn)行東北刺人參不定根培養(yǎng)時(shí)，為了提高不定根中活性物質(zhì)含量，在培養(yǎng)30 d后加入誘導(dǎo)子處理8 d，所獲得的不定根的生物量與未經(jīng)誘導(dǎo)子處理培養(yǎng)38 d的不定根無明顯差異，每個(gè)反應(yīng)器均可得到約50 g不定根干品(數(shù)據(jù)沒顯示)。對(duì)2種不定根水提物中總酚和總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，E2中總酚和總黃酮含量均高于E1，總酚含量為E1的3.2倍，總黃酮為2.7倍(表1)。說明在生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中利用誘導(dǎo)子處理東北刺人參不定根可提高活性物質(zhì)的含量。東北刺人參2種不定根提取物因所含的酚和黃酮含量不同，在進(jìn)一步的抗炎活性試驗(yàn)中可能會(huì)產(chǎn)生不同的效果。

表1 東北刺人參2種不定根水提物中總酚和黃酮的含量

注：E1為反應(yīng)器培養(yǎng)38 d的不定根水提物，E2為反應(yīng)器培養(yǎng)30 d后誘導(dǎo)子處理8 d的不定根水提物，下同；與E 1比較，*P<0.05

2.2東北刺人參不定根提取物對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響

為了探明2種不定根水提物的抗炎活性，通過檢測(cè)不同濃度的提取物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性，確定了無毒性的提取物濃度用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。由圖1可知，用25～200 μg/mL不定根提取物處理后，小鼠巨噬細(xì)胞的活性未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，說明此濃度范圍內(nèi)的不定根提取物無毒性，在抗炎活性試驗(yàn)中提取物濃度選擇低于200 μg/mL即可。

注：E1為反應(yīng)器培養(yǎng)38 d的不定根水提物，E2為反應(yīng)器培養(yǎng)30 d后誘導(dǎo)子處理8 d的不定根水提物

圖1東北刺人參不定根提取物對(duì)細(xì)胞活性的影響
Fig.1EffectofO.elatusadventitiousrootextractsoncellviability

2.3東北刺人參不定根水提物對(duì)促炎介質(zhì)水平的影響

E1：為反應(yīng)器培養(yǎng)38 d的不定根水提物；E2：為反應(yīng)器培養(yǎng)30 d后誘導(dǎo)子處理8 d的不定根水提物；與LPS組比較，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

圖2東北刺人參不定根提取物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO和TNF-釋放量的影響

Fig.2EffectofO.elatusadventitiousrootextractsonNOandTNF-productionofPMs

E1：為反應(yīng)器培養(yǎng)38 d的不定根水提物，E2：反應(yīng)器培養(yǎng)30 d后誘導(dǎo)子處理8 d的不定根水提物；與LPS組比較，**P<0.01

圖3東北刺人參不定根提取物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1分泌的影響

Fig.3EffectofO.elatusadventitiousrootextractsonIL-1βproductionofPMs

3 討論與結(jié)論

將生物反應(yīng)器培養(yǎng)的植物細(xì)胞、組織或器官作為原材料用于相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)中是解決植物材料短缺的有效方法[11-13]。然而，欲使反應(yīng)器培養(yǎng)的植物材料中活性物質(zhì)生產(chǎn)量達(dá)到較高水平，在培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，使用誘導(dǎo)子最為有效。誘導(dǎo)子作為一種常用的非生物誘導(dǎo)子已在許多植物種的細(xì)胞和器官培養(yǎng)中得以應(yīng)用，并發(fā)現(xiàn)其具有良好的促進(jìn)活性物質(zhì)積累的效果[14-16]。本研究中，東北刺人參不定根在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)30 d后，加入誘導(dǎo)子處理8 d，所得到的不定根中總酚和總黃酮含量顯著高于未經(jīng)誘導(dǎo)子處理的不定根?？梢?，誘導(dǎo)子的使用是東北刺人參不定根生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中提高活性物質(zhì)含量的一個(gè)重要的措施。

東北刺人參作為具有極高藥用價(jià)值的珍稀植物，具有多種生物活性。然而，比起其它五加科植物，因資源的嚴(yán)重短缺，東北刺人參的相關(guān)研究受到阻礙，使得產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)受到限制[17]。 在東北刺人參抗炎方面的研究幾近空白的狀態(tài)下，該研究所進(jìn)行的東北刺人參不定根抗炎活性的初步研究，對(duì)于今后進(jìn)一步開展其抗炎特性和機(jī)制的研究及其相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)具有極高的參考價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)子處理和未處理的2種不定根水提物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的NO和促炎因子TNF-及IL-1的產(chǎn)生具有不同程度的抑制效果，誘導(dǎo)子處理的不定根水提物(E2)抑制NO、TNF-及IL-1的效果顯著，高于未經(jīng)誘導(dǎo)子處理的不定根水提物(E1)。這可能與E2中含有的酚及黃酮含量多于E1有關(guān)，這種結(jié)果與許多研究所闡述的酚和黃酮具有抗炎作用相吻合[18-19]。因此，誘導(dǎo)子處理的不定根可用于東北刺人參抗炎相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)中，但對(duì)不定根的提取方法及抗炎特性及機(jī)制等方面需進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

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EffectofOpolopanaxelatusNakaiadventitiousrootsonthelevelsofpro-inflammatorymediatorsinmacrophagesinducedbyLPS

LI He, JIANG Jun, JIANG Xiaolong, LIU Guanpu, LIAN Meilan, PIAO Xuanchun*

(KeyLaboratoryofNaturalResourcesofChangbaiMountain&FunctionalMoleculesofMinistryofEducation,YanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

OplopanaxelatusNakai is a plant of Araliaceae with ornamental and medicinal values. To promote the product development ofO.elatus, the adventitious roots replaced the field grown plants in the anti-inflammatory production. In the present study, the water extracts ofO.elatusadventitious roots, which cultured with the untreated bioreactor (E1) and the treated bioreactor with an elicitor (E2), was used to treat the peritoneal macrophages of the mice. The anti-inflammatory activity was investigated by measuring the levels of NO, TNF-, and IL-1β. In the water extracts of the E1 group and the E2 group, the total phenol and total flavonoid contents was different. The total phenol and the flavonoid contents in E2 group were 3.2 fold and 2.7 fold more than that in the E1 group. The effect of the both extracts on the production of NO, TNF-, and IL-1β was also different, three pro-inflammatory mediators were all inhibited by the E2 group, while only NO was inhibited by the E1 group; the anti-inflammatory activity of the E2 group was higher than that of the E1 group. Consequently, bioreactor cultured adventitious roots treated with elicitor can be used in the anti-inflammatory production ofO.elatusin the future.

adventitious root; elicitor; macrophage; pro-inflammatory mediator

2017-04-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260182和31660080)

李賀(1991—)，女，吉林松原人，在讀碩士，研究方向?yàn)橹参锝M織培養(yǎng)及生物反應(yīng)器的應(yīng)用。樸炫春為通信作者，

E-mail: mllian@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)03-0013-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.003

R285.5

A