康小龍，何承輝，盧 軍，劉 晶

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830000； 2. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004)

【實驗研究】

刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮病小鼠Endoglin等影響?

康小龍1，何承輝2△，盧 軍1，劉 晶1

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830000； 2. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004)

目的:觀察刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮病(SSc)小鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、Endoglin及白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平的影響。方法:BALB/c小鼠90只按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、青霉胺組及刺山柑總生物堿低、中、高劑量組。除空白對照組外，其余各組小鼠背部皮下注射鹽酸博萊霉素建立SSc模型。成模后給藥8周，ELISA法測定小鼠皮膚和肺組織α-SMA、皮膚組織Endoglin和血清MMP-1、IL-6水平。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組小鼠皮膚和肺組織α-SMA、皮膚組織Endoglin和血清IL-6水平升高，血清MMP-1水平降低；與模型組比較，刺山柑總生物堿高劑量組α-SMA、Endoglin和IL-6水平降低，MMP-1水平升高。結(jié)論:刺山柑總生物堿可減少SSc α-SMA表達(dá)，降低Endoglin和IL-6的異常升高，升高M(jìn)MP-1水平，改善SSc組織纖維化。

刺山柑總生物堿；系統(tǒng)性硬皮?。沪?平滑肌肌動蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶-1；Endoglin；白細(xì)胞介素-6

系統(tǒng)性硬皮病(systemic sclerosis, SSc)是一種危及皮膚和內(nèi)臟器官的結(jié)締組織疾病，以皮膚增厚和內(nèi)臟器官纖維化為主要臨床表現(xiàn)[1]。刺山柑(CapparisspinosaL.)又名槌果藤、野西瓜、老鼠瓜，為白花菜科(Capparaceae)山柑屬(CapparisL.)植物，系維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材之一，主要用藥部位為果實等，其性味辛苦溫，具有祛風(fēng)散寒、除濕、消腫止痛、擴(kuò)張血管的功效。有研究表明，刺山柑果實乙醇提取物可抑制SSc患者成纖維細(xì)胞增殖及Ⅰ型膠原的合成[2]；刺山柑鮮果75%乙醇調(diào)制的糊膏以及刺山柑干果流浸膏均能顯著抑制硬皮病模型小鼠的真皮增厚和膠原沉積[3]。李凡等[4]用刺山柑治療硬皮病患者6例，獲較滿意療效。本課題組從刺山柑果實中提取了有效部位刺山柑總生物堿，擬用于SSc的治療。本實驗觀察了刺山柑總生物堿對SSc小鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、Endoglin及白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平的影響，以探討其抗SSc組織纖維化的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡清潔級BALB/c小鼠，體質(zhì)量18～24 g，購自新疆實驗動物研究中心(合格證號SCXK(新)2003-0002)。

1.1.2 藥材與試劑 刺山柑藥材購自新疆麥迪森維藥有限公司飲片廠，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江研究員鑒定為正品；鹽酸博萊霉素粉針劑，日本化藥株式會社(批號430312)；青霉胺片，上海信誼藥廠(批號052130503)。

刺山柑總生物堿制備方法：取刺山柑果實曬干粉碎后加10倍量95%乙醇，80 ℃水浴中提取2次，每次0.5 h濃縮干燥，得刺山柑總生物堿，經(jīng)UV測定，總生物堿含量為32%以上。

刺山柑總生物堿乳膏制法：將提取的刺山柑總生物堿與白凡士林、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、月桂氮卓酮等基質(zhì)混勻，水浴加熱至90 ℃熔融后為油相；水相為濃縮液與甘油混勻后水浴加熱至90 ℃；乳化劑為十二烷基硫酸鈉、對羥基苯甲酸乙酯加入適量水中，水浴加熱溶解；待油相、水相溫度降至85 ℃后，將水相和乳化劑加入油相中，邊加邊攪拌使之乳化完全。

小鼠α-SMA ELISA試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技公司，批號201602)；小鼠Endoglin ELISA試劑盒(武漢華美生物科技公司，批號J27030162)；小鼠IL-6 ELISA試劑盒(美國R&D公司，批號201603)；小鼠MMP-1 ELISA試劑盒(上海江萊生物科技公司，批號201602)；二辛可寧酸蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，批號20160320)。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀，購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 SSc模型的建立及給藥方法 取雌性BALB/c小鼠90只，體質(zhì)量(21.9±1.8) g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、刺山柑總生物堿低(225 mg·kg-1)、中(450 mg·kg-1)、高(900 mg·kg-1)劑量組及陽性藥青霉胺組(125 mg·kg-1)組各15只，采用博萊霉素皮下注射法誘導(dǎo)SSc模型[5]。將小鼠背部中央?yún)^(qū)被毛剃除，鹽酸博萊霉素粉針劑用生理鹽水溶解，配成濃度為300 μg·mL-1藥液，注射入模型組及各給藥組小鼠背部皮下，空白對照組小鼠背部皮下注射生理鹽水0.1 mL/d共30 d，模型組小鼠背部注射部位出現(xiàn)皮膚增厚、彈性變差等病理改變。30 d后，刺山柑總生物堿各劑量組小鼠背部用刺山柑總生物堿乳膏外敷，青霉胺組灌胃給予青霉胺，空白對照組、模型組背部外敷不含藥基質(zhì)，每日1次，連續(xù)60 d。

1.2.2 小鼠皮膚及肺組織α-SMA和皮膚組織Endoglin水平測定 末次給藥后4 h處死小鼠，取小鼠背部注射區(qū)皮膚及肺組織制成10%組織勻漿，3 500 r/min離心10 min分離上清。上清液中α-SMA和Endoglin含量采用ELISA試劑盒測定，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，同時用二辛可寧酸蛋白定量試劑盒檢測上清液中總蛋白濃度，以每毫升上清液中總蛋白含量校正ELISA結(jié)果。

1.2.3 小鼠血清MMP-1和IL-6含量測定 末次給藥后4 h，取小鼠靜脈血，4000 r/min離心10 min后分離血清，ELISA法測定MMP-1和IL-6含量，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

表1顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠皮膚及肺組織α-SMA、皮膚組織Endoglin、血清IL-6含量明顯升高，血清MMP-1含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，900 mg·kg-1刺山柑總生物堿和125 mg·kg-1青霉胺可降低α-SMA、Endoglin、IL-6含量，升高M(jìn)MP-1含量(P<0.05或P<0.01)；與青霉胺組比較，刺山柑總生物堿高劑量組α-SMA、Endoglin和MMP-1含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 刺山柑總生物堿對系統(tǒng)性硬皮病小鼠α-SMA、Endoglin、MMP-1和IL-6水平的影響

注：與空白對照組比較:aP<0.01；與模型組比較:bP<0.05，cP<0.01

3 討論

SSc患者皮膚和內(nèi)臟器官成纖維細(xì)胞被異常激活，增殖性和合成膠原能力增強(qiáng)，部分細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并表達(dá)α-SMA，最終導(dǎo)致皮膚硬化和內(nèi)臟器官纖維化[6]。本研究也發(fā)現(xiàn)，SSc模型組小鼠皮膚及肺組織α-SMA水平較空白對照組顯著增高，900 mg·kg-1刺山柑總生物堿可明顯降低α-SMA水平。本課題組前期研究表明，經(jīng)刺山柑總生物堿治療后的SSc小鼠真皮鱗狀上皮變薄，皮膚及肺組織羥脯氨酸、Ⅰ型膠原水平降低[7]；病理觀察結(jié)果表明，刺山柑總生物堿可明顯改善SSc小鼠皮膚和肺部炎癥和纖維化[8]。以上結(jié)果提示，刺山柑總生物堿可能通過抑制SSc纖維化形成過程中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，抑制膠原合成，改善SSc組織纖維化。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一種重要的蛋白水解酶，是ECM降解過程中必不可少的酶類， 其中MMP-1是最早被純化和cDNA克隆的脊椎動物膠原酶，可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ和Ⅹ型膠原及蛋白多糖。研究表明[9]，局限性硬皮病患者與健康對照組體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞相比，MMP-1表達(dá)量下降；Tsou等[10]發(fā)現(xiàn)，SSc患者成纖維細(xì)胞MMP-1表達(dá)較正常對照組顯著降低，提示MMP-1可能參與SSc組織纖維化的形成。本研究表明，SSc模型組小鼠血清MMP-1含量較空白對照組顯著降低，900 mg·kg-1刺山柑總生物堿可明顯升高M(jìn)MP-1水平，提示刺山柑總生物堿可能通過增加MMP-1表達(dá)，減少膠原合成，使SSc ECM降解增加，改善SSc組織纖維化。

Endoglin又名CD105，是一種細(xì)胞膜糖蛋白，在TGF-β信號通路中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，參與血管發(fā)育與重塑[11]。研究表明，硬皮病患者纖維化過程中內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞Endoglin表達(dá)增加[12-13]，SSc患者尤其是伴有肺動脈高壓者，血清可溶性Endoglin水平較正常人升高[14]。動物實驗也表明，發(fā)生纖維化的硬皮病模型動物Endoglin表達(dá)增加[15]，以上研究提示Endoglin可能涉及纖維化的形成。本實驗發(fā)現(xiàn)，SSc模型組小鼠皮膚組織Endoglin水平較空白對照組明顯增高，900 mg·kg-1刺山柑總生物堿可降低Endoglin含量，提示刺山柑總生物堿對SSc Endoglin的異常表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用。

IL-6是一種多效細(xì)胞因子，參與B和T淋巴細(xì)胞的增殖與分化、抗體生成及T淋巴細(xì)胞激活[16]。研究表明[17-18],IL-6可能與SSc發(fā)病密切相關(guān)，SSc患者血清和皮損組織IL-6水平較正常人增高，其外周血白細(xì)胞生成IL-6增加，且IL-6水平與皮膚厚度呈正相關(guān)；另外，用抗IL-6受體單克隆抗體可以改善硬皮病模型動物皮膚纖維化[19]。本研究表明，刺山柑總生物堿高劑量可降低SSc小鼠血清IL-6水平，提示刺山柑總生物堿對SSc IL-6異常升高有一定的調(diào)節(jié)作用。

[1] 李楊，鄧丹琪. 系統(tǒng)性硬皮病治療的研究進(jìn)展[J]. 中國皮膚性病學(xué)雜志，2011，25(5)：393-396.

[2] 曹越蘭，李欣，鄭敏. 槌果藤對進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥患者成纖維細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原產(chǎn)生的影響[J]. 中國中藥雜志，2008，33(5)：560-562.

[3] 曹越蘭，李欣，王群. 槌果藤對硬皮病小鼠模型皮膚硬化抑制作用的實驗研究[J]. 中國中藥雜志，2008，33(2)：215-217.

[4] 李凡，阿曼古力，阿不力克木，等. 維吾爾藥槌果藤治療硬皮病6例[J]. 中華皮膚科雜志，1997，30 (1)：51.

[5] 閆小寧，張建榮，李文彬，等. 溫陽除痹湯對硬皮病模型小鼠CTGF的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2013，12(1)：13-16.

[6] BHATTACHARYYA S, WEI J, VARGA J. Understanding fibrosis in systemic sclerosis: shifting paradigms, emerging opportunities[J]. Nat Rev Rheumatol, 2011, 8(1): 42-54．

[7] 康小龍，何承輝，田紅林，等. 刺山柑總生物堿乳膏外用對系統(tǒng)性硬皮病小鼠組織纖維化的改善作用[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33(1)：32-35.

[8] 康小龍，何承輝，劉晶，等. 刺山柑總生堿對系統(tǒng)性硬皮病小鼠Ⅲ型膠原表達(dá)的影響[J]. 中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，45(8)：688-691

[9] 朱晨雨，孫秋寧. UVA-1及UVA照射對局限性硬皮病患者成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原和MMP-1表達(dá)的影響[J]. 國際皮膚性病學(xué)雜志，2012，38(4)：217-220.

[10] TSOU PS, BALOGH B, PINNEY AJ, et al. Lipoic acid plays a role in scleroderma: insights obtained from scleroderma dermal fibroblasts[J]. Arthritis Res Ther, 2014, 16(5): 411-424.

[11] MORRIS E, CHROBAK I, BUJOR A, et al. Endoglin promotes TGF-β/Smad1 signaling in scleroderma fibroblasts[J]. J Cell Physiol, 2011, 226(12): 3340-3348.

[12] HOLMES AM, PONTICOS M, SHI-WEN X, et al. Elevated CCN2 expression in scleroderma: a putative role for the TGFbeta accessory receptors TGFbetaRIII and endoglin[J]. J Cell Commun Signal, 2011, 5(3): 173-177.

[13] MORRIS E, CHROBAK I, BUJOR A, et al. Endoglin promotes TGF-beta/Smad1 signaling in scleroderma fibroblasts[J]. J Cell Physiol, 2011, 226(12): 3340-3348.

[14] CORAL-ALVARADO P, QUINTANA G, GARCES MF, et al. Potential biomarkers for detecting pulmonary arterial hypertension in patients with systemic sclerosis[J]. Rheumatol Int, 2009, 29(9), 1017-1024.

[15] DOCHERTY NG, LOPEZ-NOVOA JM, AREVALO M, et al. Endoglin regulates renal ischaemia-reperfusion injury[J]. Nephrol Dial Transplant, 2006, 21(8): 2106-2119.

[16] DESALLAIS L, AVOUAC J, FRECHET M, et al. Targeting IL-6 by both passive or active immunization strategies prevents bleomycin-induced skin fibrosis[J]. Arthritis Res Ther, 2014, 16(4): R157.

[17] DE LAURETIS A, SESTINI P, PANTELIDIS P, et al. Serum interleukin-6 is predictive of early functional decline and mortality in interstitial lung disease associated with systemic sclerosis[J]. J Rheumatol, 2013, 40(4): 435-446.

[18] JURISIC Z, MARTINOVIC-KALITERNA D, MARASOVIC-KRSTULOVIC D, et al. Relationship between interleukin-6 and cardiac involvement in systemic sclerosis[J]. Rheumatology (Oxford), 2013, 52(7): 1298-1302.

[19] KITABA S, MUROTA H, TERAO M , et al. Blockade of interleukin-6 receptor alleviates disease in mouse model of scleroderma[J]. Am J Pathol, 2012, 180(1): 165-176.

EffectsoftotalAlkaloidsfromSpinosaonEndoglininMicewithSystemicSclerosis

KANG Xiao-long1, HE Cheng-hui2△, LU Jun1, LIU Jin1

(1.HospitalofChineseMedicineAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China; 2.XinjiangMedicineResearchInstitute,Urumqi830004,China)

Objective To observe the effects of capparis spinosa total alkaloid on the α-smooth muscle actin (α-SMA), matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), Endoglin and interleukin-6 (IL-6) levels in mice models of systemic sclerosis (SSc). Methods Totally 90 BALB/c mice were randomly divided into control group, model group, penicillamine group and capparis spinosa total alkaloid low-, medium- and high-dose group. Mice models with SSc were established by repeated local injections of bleomycin in mice back, except for the control group. After treatment by medicine for 8 weeks, the levels of α-SMA in skin and lung tissue, Endoglin in skin tissue and MMP-1, IL-6 in serum were measured by ELISA. Results The levels of α-SMA in skin and lung tissue, Endoglin in skin tissue and IL-6 in serum were markedly lowered and MMP-1 in serum was markedly increased by high-dose capparis spinosa total alkaloid than in model group mice. Conclusion Capparis spinosa total alkaloid could ameliorate fibrosis of SSc by down-regulating expression of α-SMA, Endoglin, IL-6 and up-regulating expression of MMP-1.

Capparis spinosa total alkaloid; Systemic sclerosis; α-smooth muscle actin; Endoglin; Interleukin-6; Matrix metalloproteinase-1

R285.5

B

1006-3250(2017)10-1384-03

國家自然科學(xué)基金資助項目(81260235)-刺山柑總生物堿改善系統(tǒng)性硬皮病組織纖維化的作用機(jī)理研究

康小龍(1975-)，男，陜西扶風(fēng)人，副主任藥師，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥作用機(jī)制研究。

△通訊作者：何承輝(1974-)，女，四川自貢人，副研究員，醫(yī)學(xué)碩士，碩士研究生導(dǎo)師，從事藥物新制劑與新劑型研究，Tel：0991-5853365，E-mail: 408705201@qq.com。

2017-04-22