牟鳳林，陳 華

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404100)

【實(shí)驗(yàn)研究】

青藤堿誘導(dǎo)人紅白血病細(xì)胞株K562凋亡的實(shí)驗(yàn)研究?

牟鳳林，陳 華△

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404100)

目的: 通過青藤堿(Sinomeine，SIN)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，研究SIN誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡機(jī)制。方法: CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)(FMC)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Hoechst 33258染色細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，Real-time PCR檢測(cè) bcl-2和bax 基因表達(dá)，Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果: CCK-8和FCM結(jié)果顯示，SIN可抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其早期凋亡；Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，經(jīng)SIN誘導(dǎo)48h后表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的典型變化；Real-time PCR結(jié)果顯示， SIN組bax基因表達(dá)升高，bcl-2基因表達(dá)降低；Western blot結(jié)果顯示，SIN組中Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低。結(jié)論: SIN可誘導(dǎo)K562病細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞增殖。

青藤堿；K562細(xì)胞；bcl-2；bax；細(xì)胞凋亡

白血病(Leukemia)是一種克隆性起源的造血系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，已成為我國(guó)年輕人最常見的惡性腫瘤之一[2-3]。目前用于治療白血病的常用方法費(fèi)用昂貴、毒副作用較大且易產(chǎn)生耐藥性，因此急需探索一種價(jià)格合適、毒副作用小、安全高效的抗白血病藥物[4]。青藤堿(sinomenine，SIN)是從原產(chǎn)于中國(guó)和日本的植物青風(fēng)藤中發(fā)現(xiàn)的一種生物堿，作為傳統(tǒng)的中藥成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)明確，對(duì)風(fēng)濕病和關(guān)節(jié)炎有較好的療效。最近的研究表明，青藤堿具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[5-8]，但其有關(guān)青藤堿對(duì)白血病細(xì)胞作用的相關(guān)報(bào)道較少。本文通過青藤堿體外誘導(dǎo)人紅白血病K562細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究，初步探索青藤堿對(duì)白血病細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 材料方法

1.1 藥品與試劑

青藤堿購(gòu)自成都鉅龍?zhí)烊凰帢I(yè)生命科技有限公司(純度99%)，紫杉醇(Taxol)購(gòu)自美國(guó)Bristol Caribbean公司，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、PBS購(gòu)自GIBCO公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；PCR特異性引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成(中國(guó))，Taq酶、DNase I(RNase free)、RNA提取試劑RNAiso Plus及PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(PMSF)、SDS-PAGE凝膠試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自密理博公司，ECL顯色劑購(gòu)自美國(guó)GE醫(yī)療生命科學(xué)，兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗體購(gòu)自宜康生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞

人紅白血病細(xì)胞株(K562細(xì)胞)由重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術(shù)研究中心饋贈(zèng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱、MK3酶標(biāo)儀由美國(guó) ThermoFisher公司生產(chǎn)， DM2500倒置顯微鏡、M70D倒置熒光顯微鏡由德國(guó)Leica公司生產(chǎn)，C6流式細(xì)胞儀由美國(guó)BD公司生產(chǎn)，ABI7500 Real-time PCR定量?jī)x由美國(guó)ABI公司生產(chǎn)，Western blot電泳儀由美國(guó)BIORAD公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 青藤堿工作溶液配制 青藤堿分子式C19H23NO4，分子量為329.39 g/mol，取3.23 g青藤堿溶解于1 mL二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，配置成10 mol/L母液，再加9 mL RPMI1640稀釋成1000 mmol/L工作液。

1.4.2 K562細(xì)胞培養(yǎng)及分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含5% FBS)懸浮細(xì)胞，調(diào)整密度5×105/ml，接種于6孔板，每孔4 mL。實(shí)驗(yàn)分組：本底對(duì)照組只加RPMI 1640完全培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加含最大劑量0.1% DMSO的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組濃度為0.1 μmol/L紫杉醇(Taxol)處理，藥物組終濃度為1、2、4、8 mmol/L的SIN，在37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)12、24、48、72 h。

1.4.3 CCK-8法檢測(cè)K562細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為8×105/ml，接種至96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。本底對(duì)照組只加RPMI 1640完全培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加含最大劑量0.1% DMSO的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加0.1 μmol/L的紫杉醇(Taxol)，藥物組終濃度為1、2、4、8 mmol/L的SIN，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)12、24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，輕輕震蕩使之混勻，繼續(xù)孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)的條件下檢測(cè)各孔的吸光度值(A)，同時(shí)計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的抑制率和各個(gè)作用時(shí)間點(diǎn)的半數(shù)抑制濃度(IC50)，以IC50為標(biāo)準(zhǔn)確定最適合的藥物作用濃度和時(shí)間，實(shí)驗(yàn)做3次重復(fù)。抑制率(IR%)={1-A450SIN (S)組/A450空白對(duì)照組}×100%。

1.4.4 FCM檢測(cè)SIN對(duì)K562凋亡的影響 收集各組細(xì)胞，用PBS(pH7.2)洗滌2次， 1500 r/min離心5 min，100 μL PBS重懸細(xì)胞，加20 μL Annexin V-FITC/PI染料，在4 ℃避光的條件下染色處理30 min，染色完成后用PBS洗滌1遍，最后用300μl PBS重懸細(xì)胞，每組取1×104個(gè)細(xì)胞上流式細(xì)胞儀做流式檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 Hoechst 33258染色 培養(yǎng)48 h后，收集空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和分別經(jīng)1、2、4和8 mmol/L SIN處理的藥物組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加甲醇/乙醇(3∶1)固定液室溫固定15 min；離心去除固定液加Hoechst 33258染色液避光、室溫染色30 min，PBS洗滌1次，再加PBS制成細(xì)胞懸液滴在載玻片上，50%甘油封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察、采圖。

1.4.6 Real-time PCR 檢測(cè)SIN對(duì)K562細(xì)胞bcl-2和bax基因表達(dá)的影響 收集培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞，按照試劑盒方法裂解細(xì)胞提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，以合成的cDNA作為模板，β-actin基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 cycles。引物序列為：Bcl-2上游引物：GTTTAAATGGGCATTTGTTTGC，下游引物：CCAACCATGGTTGGTCTGC，探針：GAGAGTTCCTCTCTTTCAGC，Bax上游引物：CTGAGCAGATCATGAAGACAG，下游引物：GCTTGAGACACTCGTCAGCTTC，探針：GAGCTGGCCCTGGACCCGGT，β-actin上游引物：GTGATGGTGGGCATGGGTCAG，下游引物：GCAGAAGGTGTGGTGCCAGA，探針：GTACCCCATCGAGCACGGCA。最終數(shù)據(jù)使用2-△ △Ct公式計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.7 Western blot檢測(cè)SIN對(duì)K562細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取K562細(xì)胞的總蛋白， BCA法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白的濃度，調(diào)節(jié)各組蛋白的濃度使其終濃度一致。每組取40 μg的蛋白樣品，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，電泳完成后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5% BSA室溫封閉2 h后，用TBST漂洗3次，每次5 min，分別加入1∶2000稀釋的抗Bcl-2、Bax、Caspase-3(激活型)抗體及內(nèi)參照抗 β-actin抗體，室溫孵育4 h；用TBST漂洗3次，每次5 min，分別加入稀釋度均為1∶1000的二抗，室溫條件下孵育2 h，再用TBST漂洗3次，每次5 min，之后用ECL顯色劑化學(xué)發(fā)光再用X光膠片曝光顯影，最后掃描儀掃描后用Quantity One軟件進(jìn)行定量分析，目的蛋白的表達(dá)水平用目的條帶與內(nèi)參的灰度值之比表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SIN對(duì)K562細(xì)胞的增殖具有抑制作用

表1顯示，在1、2、4、8 mmol/L的濃度范圍內(nèi)SIN可以有效抑制K562細(xì)胞的增殖，在處理48 h時(shí)各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著SIN濃度的增加和作用于細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)，8 mmol/L SIN處理組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SIN作用K562細(xì)胞12、24、48、72 h的半抑制濃度(IC50)分別為9.8、6.8、4.2、3.9 mmol/L。

表1 SIN對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用

注：SIN處理K562細(xì)胞后與1 mmol/L比較:*P<0.05

表2 SIN可誘導(dǎo)K562細(xì)胞早期凋亡[例(%)]

注：SIN處理K562細(xì)胞后與control比較:*P<0.05

2.2 SIN可誘導(dǎo)K562細(xì)胞早期凋亡

圖1表2顯示，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果示在 2、4、8 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，SIN作用于K562細(xì)胞48 h能夠誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡，并隨著SIN濃度的增高早期凋亡率隨之升高，8 mmol/LSIN處理組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與空白對(duì)照組早期凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 SIN作用48 h后Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)K562細(xì)胞凋亡(箭頭所指為凋亡細(xì)胞所處位置)注：A.對(duì)照組；B.1 mmol/L SIN；C.2 mmol/L SIN；D.4 mmol/L SIN； E.8 mmol/L SIN；F.positive control

2.3 Hoechst 33258染色

圖2顯示，空白對(duì)照組的K562細(xì)胞發(fā)出均勻的淡藍(lán)色熒光，細(xì)胞核無明顯的凋亡形態(tài)學(xué)變化；陽(yáng)性對(duì)照組和分別經(jīng)2、4、8 mmol/L的SIN誘導(dǎo)48 h后，細(xì)胞的核染色質(zhì)濃縮聚集、核碎裂、核邊集，并發(fā)出較強(qiáng)的藍(lán)色熒光呈亮白色，表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的典型變化，且濃度越高變化越明顯。

圖3 Hoechst 33258染色照片(×400)(箭頭所指位置為凋亡細(xì)胞群體所處位置)注：A.對(duì)照組;B.1 mmol/L SIN;C.2 mmol/L SIN;D.4 mmol/L SIN; E.8 mmol/L SIN;F.positive control

2.4 Real-time PCR 檢測(cè)SIN對(duì)K562細(xì)胞bcl-2和bax基因表達(dá)的影響

表3顯示，Real-time PCR示經(jīng)2、4、8 mmol/L SIN處理48 h后，實(shí)驗(yàn)組K562細(xì)胞的bax基因表達(dá)與較空白對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；8 mmol/LSIN處理組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。bal-2基因的表達(dá)水平較空白對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；8 mmol/L SIN處理組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5 SIN對(duì)K562細(xì)胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響

圖3表4顯示，K562細(xì)胞經(jīng) 2、4、8 mmol/L SIN作用48 h后，SIN實(shí)驗(yàn)組中Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，8 mmol/LSIN處理組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，8 mmol/LSIN處理組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 SIN可誘導(dǎo)K562細(xì)胞早期凋亡

注：SIN處理K562細(xì)胞后與control比較:*P<0.05

表4 SIN可誘導(dǎo)K562細(xì)胞早期凋亡

注：SIN處理K562細(xì)胞后與control比較:*P<0.05

圖3 Western blot檢測(cè)K562細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)

3 討論

白血病患者造血細(xì)胞增殖不受控制，分化成熟及正常的凋亡途徑均受到影響，進(jìn)而造成大量的異常分化細(xì)胞增殖[9]，形成白血病癥狀。目前，白血病的治療方法主要是大劑量聯(lián)合化療，但該方法不良反應(yīng)多，復(fù)發(fā)率高，因此尋找一種副作用小且對(duì)機(jī)體免疫和造血系統(tǒng)抑制程度小的新藥是當(dāng)務(wù)之急。

中藥如紫杉醇、人參、當(dāng)歸、黃芪等具有明顯防治癌癥作用，可顯著延長(zhǎng)患者生存期，提高患者生活質(zhì)量。尤其是紫杉醇是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的抗癌中藥有效成分，可以通下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax和激活Caspase-3來誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞凋亡[10]，故本文用紫杉醇作陽(yáng)性對(duì)照。

青藤堿是從防己科植物青藤干燥藤莖提取的生物堿單體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)已研究清楚。最近的研究表明，SIN具有抗腫瘤的作用。Jiang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SIN可通過增加細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)，降低Bal-2蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞NCI-H460的凋亡；Li等[12]報(bào)道，SIN可以通過MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞停滯在G1/S細(xì)胞周期，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡；Lv等[13]研究表明，SIN可抑制COX-2的表達(dá)抗胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖。

本研究使用CCK-8法證實(shí)在1-8 mmol/L的濃度內(nèi)SIN可有效抑制K562細(xì)胞增殖，且這一作用呈濃度依賴關(guān)系。我們進(jìn)一步通過Hoechst 33258染色和FCM實(shí)驗(yàn)顯示，SIN可誘導(dǎo)K562早期凋亡，產(chǎn)生抗白血病細(xì)胞增殖作用。Bcl-2蛋白為細(xì)胞存活促進(jìn)因子，屬于膜整合蛋白，在一些腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)；Bcl-2蛋白內(nèi)定位于細(xì)胞核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體上，通過阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放發(fā)揮抗凋亡作用；Bax蛋白是Bcl-2家族中參與細(xì)胞凋亡的重要成員之一[14]，當(dāng)細(xì)胞受到外界干擾或者刺激發(fā)生凋亡時(shí)發(fā)生遷移、釋放，激活Caspase家族，產(chǎn)生Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序[15]；細(xì)胞中Bcl-2/Bax的比例決定該細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了執(zhí)行細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白因子Caspase-3[16-17]和與細(xì)胞凋亡相關(guān)的Bcl-2家族成員bcl-2、bax基因以及Bcl-2、Bax蛋白[3,18]的表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果顯示，SIN能夠降低bcl-2基因的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)bax基因的表達(dá)。此外，Western blot結(jié)果顯示，SIN 能有效抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax并激活Caspase-3蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并隨著處理濃度的增加該現(xiàn)象越明顯。這與Real-time PCR結(jié)果一致。也有文獻(xiàn)報(bào)道，SIN 可通過Caspase-3依賴方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。此外也有研究者認(rèn)為，SIN 可通過提高Bax蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[20]。

綜上所述，SIN在1、2、4、8 mmol/L濃度范圍內(nèi)均能有效抑制人紅白血病K562細(xì)胞增殖，并通過下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax和激活Caspase-3來誘導(dǎo)其早期凋亡，這一研究為青藤堿用于臨床白血病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

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ExperimentalStudyonApoptosisofHumanErythroleukemiaCellLineK562InducedbySinomenine

MOU Feng-lin, CHEN Hua△

(ChongqingThreeGorgesMedicalCollege,Chongqing404100,China)

Objective: To grope preliminarily the effects of Sinomenine(SIN) on the proliferation inhibition, apoptosis of human erythroleukemia cell line K562. Methods: CCK-8 assay was used to detect the K562 cell proliferation activity. K562 cell apoptotic changes were detected by Flow cytometry (FCM). The cell morphological changes of apoptosis were observed by hoechst staining.The changes of expressions of bcl-2 gene and bax gene were examined by Real-time PCR. The changes of expressions of Bcl-2、Bax and Caspase-3 proteins were examined by western blot analysis. Results: CCK-8 assay result showed that SIN can effectively inhibit the proliferation of K562 cells in vitro, which exhibits a dose-dependent manner. Flow cytometry results indicated that SIN can induce early apoptosis of K562 cells after induced by SIN, which showed statistically significant difference compared with the control group. Hoechst staining revealed that SIN could induce toypical apoptotic morphological changes. Real-time PCR showed that the expressions of bax gene was increased in dose-dependent manner after induced by SIN, while expressions of bcl-2 gene were decreased compared with the control group. Western blot showed that the expressions of Bax, Caspase-3 were increased in dose-dependent manner after induced by SIN, expressions of Bcl-2 proteins were decreased compared with the control group. Conclusion: SIN can inhibit the proliferation of K562 cells and induce its apoptosis through activating Caspase-3 up-regulating the expression of Bax, and down-regulating the expression of Bax.

Sinomenine; K562 cells; bcl-2; bax; apoptosis

R285.5

B

1006-3250(2017)10-1387-04

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目(cstc2014jcyjA10049)-構(gòu)建I型大麻受體真核表達(dá)體系制備細(xì)胞膜色譜篩選中藥中配體的研究；重慶市社會(huì)民生科技創(chuàng)新專項(xiàng)細(xì)胞色譜篩選新藥技術(shù)用于中草藥研發(fā)的示范應(yīng)用(cstc2016shmszx130028)；第二批重慶市高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(2014)

牟鳳林(1983-)，女，重慶萬(wàn)州人，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事中藥藥理研究。

△通訊作者：陳 華(1964-)，男，重慶萬(wàn)州人，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，從事生物化學(xué)研究，Tel：023-58103698，E-mail：2562307586@qq.com。

2017-04-25