徐文峰++++++徐碩++++++何笑榮++++++姜文清++++++吳學(xué)軍++++++鄺詠梅++++++金鵬飛

[摘要] 目的 應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）建立天然維生素E軟膠囊的含量測(cè)定方法。 方法 采用Alltima C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），以甲醇為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm。 結(jié)果 在本方法中，維生素E的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999；專(zhuān)屬性強(qiáng)，精密度和穩(wěn)定性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.17%和0.87%；平均加樣回收率（n = 6）為100.8%，加樣回收率良好。含量測(cè)定結(jié)果顯示3個(gè)批號(hào)樣品中維生素E的含量分別為標(biāo)示量的101.2%、100.8%、102.7%。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速，可用于天然維生素E軟膠囊的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 天然維生素E軟膠囊；維生素E；高效液相色譜法；含量測(cè)定

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）10（c）-0136-04

Determination of narural vitamin E in Natural Vitamin E Soft Capsules

XU Wenfeng XU Shuo HE Xiaorong JIANG Wenqing WU Xuejun KUANG Yongmei JIN Pengfei

Department of Pharmacy， Beijing Hospital National Center of Gerontology， Beijing 100730， China

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the determination of narural vitamin E in Natural Vitamin E Soft Capsules. Methods An Alltima C18 column （150 mm× 4.6 mm， 5 μm） was used for the separation， with methanol as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 285 nm. Results The method showed good linearity with correlation coefficient of 0.9999 for vitamin E. The assay method showed good specificity. The precision and stability were satisfactory with the relative standard deviations （RSD） of 0.17% and 0.87% respectively. The average spiked recovery was 100.8% （n = 6）， the recovery rate was good. The determination results was 101.2%， 100.8% and 102.7% of the labeled amount of the three batches of samples respectively. Conclusion The established method is accurate， simple and fast， and can be used for determination of narural vitamin E in Natural Vitamin E Soft Capsules.

[Key words] Natural Vitamin E Soft Capsules； Natural vitamin E； HPLC； Determination

維生素E為微黃色至黃色澄清的黏稠液體，幾乎無(wú)臭，遇光色漸變深，不溶于水，溶于無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，在空氣中會(huì)緩慢氧化，紫外線照射可使其分解。維生素E分為合成型或天然型，合成型為dl-α-生育酚醋酸酯，d-α-生育酚醋酸酯[1]。大量研究表明，維生素E具有抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、促進(jìn)生育、抗衰老、細(xì)胞保護(hù)等生物學(xué)功能[2-5]。維生素E屬于人體必需的植物源脂溶性維生素，機(jī)體不能合成，必須從膳食中獲取。植物油中富含天然維生素E，是膳食維生素E的主要來(lái)源[6]，同時(shí)維生素E也常被作為藥品、營(yíng)養(yǎng)保健品和食品添加劑使用。維生素E的定量方法有氣相色譜法[1，7-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12-13]、高效液相色譜法[14-17]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[18]、毛細(xì)管電泳法[19]、紅外光譜法[20]等。楊紅娟等[21]采用高效液相色譜法對(duì)天然維生素E軟膠囊中α-生育酚的含量測(cè)定進(jìn)行了研究，但高效液相色譜法測(cè)定天然維生素E軟膠囊中d-α-生育酚醋酸酯的含量尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)建立了天然維生素E軟膠囊中維生素E含量測(cè)定的方法，對(duì)于補(bǔ)充其質(zhì)量控制具有一定參考價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜系統(tǒng)，配有四元梯度泵（型號(hào)：G1311C），自動(dòng)進(jìn)樣器（型號(hào)：G1329B），柱溫箱（型號(hào)：G1316A），DAD檢測(cè)器（型號(hào)：G4212B）（安捷倫科技有限公司，美國(guó)）；Mettler XP-205型電子天平（精密度為十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多集團(tuán)，瑞士）；KQ-800KDE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，中國(guó)）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（密理博中國(guó)有限公司，美國(guó)）。endprint

1.2 試藥

無(wú)水乙醇（分析純，批號(hào)：20141113，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇[色譜純，批號(hào)：164787，賽默飛科技（中國(guó)）有限公司]；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水；甘油[批號(hào)：20851101，國(guó)藥控股星鯊制藥（廈門(mén)）有限公司]；大豆油（批號(hào)：20170519，益海嘉里食品營(yíng)銷(xiāo)有限公司）；維生素E對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：100062-201110，含量為97.7%）；天然維生素E軟膠囊[每粒含有天然維生素E 400 IU（相當(dāng)于維生素E 294.1 mg）[22]，批號(hào)：450279-12、442049-17、423022-11，美國(guó)“天然素”藥廠]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Alltima，150 mm × 4.6 mm，5 μm）；甲醇為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL；28℃。所用溶液進(jìn)樣前均經(jīng)0.22 μm孔徑尼龍濾膜過(guò)濾。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

避光操作，取維生素E對(duì)照品約250 mg，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，加適量無(wú)水乙醇，振搖使溶解，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即為維生素E儲(chǔ)備液（5.0 mg/mL）。精密量取維生素E儲(chǔ)備液1、2、3、4、5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，獲得維生素E質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。取中間濃度（1.5 mg/mL）的對(duì)照品溶液用作含量測(cè)定時(shí)的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

避光操作，精密稱(chēng)取天然維生素E軟膠囊內(nèi)容物約0.1 g（約相當(dāng)于維生素E 75 mg），置50 mL容量瓶中，加適量無(wú)水乙醇，振搖使溶解，甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

取說(shuō)明書(shū)中的輔料，制備不含維生素E的陰性空白樣品，按“2.3”項(xiàng)下操作，得到陰性對(duì)照溶液，用于本實(shí)驗(yàn)的專(zhuān)屬性研究。

2.5 專(zhuān)屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

分別取陰性對(duì)照溶液、維生素E對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣分析，考察樣品中輔料及其他成分對(duì)維生素E色譜峰的干擾。上述3種溶液的色譜圖（圖1）顯示，樣品輔料和其他成分不干擾維生素E的測(cè)定。理論板數(shù)按維生素E計(jì)算應(yīng)>4000。

2.6 線性和靈敏度

對(duì)“2.2”項(xiàng)下系列對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以維生素E的質(zhì)量濃度（mg/mL）和對(duì)應(yīng)的色譜峰面積進(jìn)行線性回歸，維生素E在質(zhì)量濃度0.4976～2.4879 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性，回歸方程為Y = 2264.22X - 1.75，線性相關(guān)系數(shù)（r）為0.9999。

將低濃度的對(duì)照品溶液以甲醇逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比（S/N）約為3.0時(shí)，確定該方法維生素E的最低檢出限（LOD）為0.12 μg/mL；當(dāng)S/N約為10.0時(shí)，測(cè)得該方法維生素E的最低定量限（LOQ）為0.50 μg/mL。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下中間濃度對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，維生素E色譜峰面積的RSD為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批天然維生素E軟膠囊樣品6份（批號(hào)：450279-12），分別制備供試品溶液，照含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，6份樣品測(cè)定結(jié)果分別為標(biāo)示量的100.9%、101.4%、102.2%、100.4%、101.4%、100.6%（平均值為標(biāo)示量的101.2%），結(jié)果維生素E含量的RSD為0.65%，說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：450279-12），置于儀器自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)，分別在0、2、4、8、12、24 h分析測(cè)定其含量，結(jié)果顯示含量基本不變，24 h內(nèi)維生素E色譜峰面積RSD為0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

在50 mL容量瓶中加入批號(hào)為450279-12的天然維生素E軟膠囊內(nèi)容物約0.1 g，精密加入維生素E儲(chǔ)備液5 mL，加適量無(wú)水乙醇，振搖，用甲醇定容，搖勻，過(guò)濾，進(jìn)樣測(cè)定。共制備6份樣品，計(jì)算加樣回收率和RSD。

2.11 樣品含量測(cè)定

應(yīng)用建立的方法對(duì)批號(hào)為450279-12、442049-17、423022-11的天然維生素E軟膠囊進(jìn)行含量測(cè)定，每個(gè)樣品制備3份，取平均值。測(cè)定結(jié)果顯示批號(hào)為450279-12、442049-17、423022-11樣品中維生素E的含量分別為標(biāo)示量的101.2%、100.8%、102.7%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜建立了天然維生素E軟膠囊含量測(cè)定的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于維生素E軟膠囊的質(zhì)量控制。

3.1 提取溶劑的選擇

適用于天然食品中的維生素E測(cè)定方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，都需要將不同構(gòu)型的微生物E皂化轉(zhuǎn)化為生育酚的形式，預(yù)處理操作繁瑣[14]?！吨袊?guó)藥典》中維生素E的含量測(cè)定為氣相色譜法，樣品提取溶劑為正己烷[1]，不適用于反相高效液相色譜。維生素E在無(wú)水乙醇中易溶，在甲醇中即使超聲30 min樣品也不能完全溶解，故實(shí)驗(yàn)中選擇無(wú)水乙醇溶解，甲醇稀釋的方法配制樣品。這樣可以避免完全用無(wú)水乙醇配制樣品時(shí)液相分析中潛在的溶劑效應(yīng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

維生素E在水中幾乎不溶，預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相即使選擇甲醇-水（98∶2），維生素E的色譜峰型也會(huì)受到影響，故實(shí)驗(yàn)采用純甲醇作為流動(dòng)相。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇endprint

靈敏度和專(zhuān)屬性是選擇檢測(cè)波長(zhǎng)需要考慮的兩個(gè)方面。分別取維生素E的對(duì)照品溶液及空白溶液進(jìn)樣，從DAD檢測(cè)器生成的紫外掃描圖上可以看到維生素E的最大吸收波長(zhǎng)為285 nm，而且空白樣品在285 nm處沒(méi)有紫外吸收。故本實(shí)驗(yàn)將285 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 注意事項(xiàng)

維生素E穩(wěn)定性較差，對(duì)光照敏感，長(zhǎng)時(shí)間光照，其溶液的峰面積會(huì)降低，本實(shí)驗(yàn)樣品配制過(guò)程需采用棕色容量瓶，液相測(cè)定時(shí)樣品需采用棕色進(jìn)樣瓶保存。

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（收稿日期：2017-07-01 本文編輯：李亞聰）endprint