王 慶 李丹丹 - 潘蕓蕓 - 吳 衛(wèi)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130) (Agronomy College, Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan 611130, China)

提取方法對天麻多糖提取率及其抗氧化活性的影響

王 慶WANGQing李丹丹LIDan-dan潘蕓蕓PANYun-yun吳 衛(wèi)WUWei

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130) (AgronomyCollege,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

分別采用熱水浸提、超聲輔助提取和酶法提取對四川平武烏天麻多糖進(jìn)行提取，并對天麻多糖提取率及其抗氧化化活性進(jìn)行比較，為篩選適合天麻多糖提取的方法提供參考。結(jié)果表明：3種提取方法對天麻多糖提取率及其抗氧化活性影響較大，其中酶法提取天麻多糖提取率最高(為50.315%)，與其他2種提取方法間差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；在DPPH和FRAP法抗氧化評價體系中，多糖抗氧化活性表現(xiàn)為超聲輔助提取>酶法提取>熱水浸提法，而在ABTS抗氧化評價體系中，其活性順序是酶法提取>超聲輔助提取>熱水浸提。綜合分析，超聲輔助提取和酶法提取有利于天麻多糖提取，且能保持其高效的抗氧化活性。

天麻；多糖；熱水浸提；超聲輔助提取；酶法提取；抗氧化活性

多糖作為生物大分子物質(zhì)存在于植物、動物和微生物中，是自然界含量最豐富的生物大分子聚合物之一[1]，在醫(yī)藥、食品以及材料等方面有著重要應(yīng)用。研究表明，多糖具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]和免疫調(diào)節(jié)[4-5]等多種生理功能，此外，多糖來源廣泛且毒副作用極低。目前關(guān)于多糖的研究逐漸成為了熱點。

天麻為蘭科真菌營養(yǎng)型多年生草本植物天麻(GastrodiaelataBl.)的干燥塊莖，是中國傳統(tǒng)名貴中藥材之一。具有息風(fēng)止痙、平抑肝陽和祛風(fēng)通絡(luò)的功效，主要應(yīng)用于小兒驚風(fēng)、癲癇抽搐、破傷風(fēng)、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木以及風(fēng)濕痹痛等癥狀[6]。經(jīng)現(xiàn)代藥理研究表明，天麻具有增智健腦[7]、清除自由基、延緩衰老[8]、保護(hù)心血管[9-10]的作用，對神經(jīng)系統(tǒng)性疾病[11-12]、老年性癡呆癥等有一定療效[13-14]。自20世紀(jì)50年代以來，在天麻中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分主要包括酚類、有機(jī)酸類、多糖類以及甾體類等[15]。

人體生活的環(huán)境必然要與外界接觸，所以必定會因呼吸、環(huán)境污染、射線等因素不斷在體內(nèi)產(chǎn)生自由基?，F(xiàn)代自由基醫(yī)學(xué)研究證明，生物體的衰老、免疫性疾病，甚至癌變等都與自由基過量產(chǎn)生有關(guān)?？寡趸饕侵缚寡趸杂苫?。已有研究表明枸杞多糖[16]、赤靈芝多糖[17]、牛蒡多糖[18]、石斛多糖[19]、銀杏葉多糖[20]等均具有清除自由基的作用。張夢娟[21]對天麻多糖進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其具有一定抗氧化活性。有研究[22]報道，提取方式對多糖活性具有一定的影響。傳統(tǒng)針對植物多糖提取多采用熱水提取法，此方法具有操作簡便、使用儀器少等特點[23]，隨著新的提取工藝不斷出現(xiàn)，在天麻多糖研究中，已有關(guān)于超聲輔助提取[24]、酶解提取[25]、微波提取[26]等方面的報道，但關(guān)于其對抗氧化活性的影響尚未見報道。盡管這些方法均各具優(yōu)缺點，但是否適宜于天麻多糖提取，需進(jìn)一步研究，故本試驗擬采用3種提取方法，對天麻多糖提取率及其抗氧化活性進(jìn)行比較，以期篩選出適合天麻多糖提取的方法，并為進(jìn)一步開發(fā)利用天麻多糖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

天麻：來自四川平武，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)吳衛(wèi)教授鑒定為烏天麻(G.elataBl.f.glaucaS. Chow)。將其蒸至透心，烘干至恒重，粉樣，過60目篩，備用。

1.2 試驗儀器和試劑

電子分析天平：CP224S型，德國賽多利斯公司；

電子恒溫水浴鍋：DZKW-4型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

粉樣機(jī)：FW-100型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-3AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：Allegra X-30R Centrifuge型，美國Beckman Conlter公司；

超聲波清洗機(jī)：SB25-12DTDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

冷凍干燥機(jī)：SJIA-10N型，寧波雙嘉儀器有限公司；

紫外-可見光光度計：UV2450型，日本Shimadzu公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan GO型，美國Thermo Scientific公司；

纖維素酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2`-聯(lián)胺-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)： 美國Sigma公司；

苯酚、硫酸、乙醇、石油醚(60～90 ℃)、無水葡萄糖、Vc等：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理 稱取天麻粉樣，加入3倍量石油醚回流脫脂4 h，重復(fù)2次，45 ℃烘干后，再加入80%乙醇以1∶8 (g/mL)的比例，于80 ℃回流提取2 h，用真空抽濾機(jī)濾去液體，重復(fù)2次，得濾渣，45 ℃烘干，備用。

1.3.2 天麻多糖提取

(1) 熱水浸提法：參考文獻(xiàn)[24～25]提取方法，修改如下：取經(jīng)過預(yù)處理的天麻樣品約10 g，按料液比1∶37 (g/mL)，提取溫度70 ℃，提取時間2.5 h，提取3次。待冷卻至室溫后，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，將上清液過濾，合并濾液并濃縮，再向提取液中緩慢加入無水乙醇至混合液乙醇終濃度為80%，置于4 ℃沉淀過夜，離心得天麻多糖沉淀，經(jīng) -50 ℃ 冷凍干燥后，-20 ℃低溫保存。

(2) 超聲輔助提取法：準(zhǔn)確稱取經(jīng)過預(yù)處理的天麻樣品約10 g，在超聲波功率250 W條件下，按料液比1∶25(g/mL)，超聲溫度40 ℃，超聲時間35 min，重復(fù)提取3次[26]。其余步驟與“1.3.2(1)”相同，得到天麻多糖沉淀。

(3) 酶法提取：參考文獻(xiàn)[27]，修改如下：稱取預(yù)處理天麻樣品約10 g，加入pH 5的檸檬酸緩沖液，使總體積為500 mL，加入纖維素酶20 mg，50 ℃水浴提取60 min，80 ℃水浴10 min使酶滅活。其余步驟與“1.3.2(1)”相同，得到天麻多糖沉淀。

1.3.3 天麻多糖含量測定

(1) 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：參考文獻(xiàn)[18]。以葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo)、吸光度值(y)為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y=5.372x-0.012，R2=0.998，葡萄糖對照品濃度的線性范圍為0.020 2～0.161 7 mg/mL。其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of Polysaccharides

(2) 天麻多糖提取液制備：稱取經(jīng)過預(yù)處理的天麻樣品1 g，按照“1.3.2”項提取得不同天麻多糖溶液，合并濾液，定容于250 mL的容量瓶中，每種提取方法重復(fù)3次。

(3) 天麻多糖含量測定：用移液管吸取1.0 mL粗多糖提取液置于試管中，依次加入蒸餾水2 mL， 5%苯酚1 mL，搖勻，滴加濃硫酸5 mL，搖勻，在室溫下靜置10 min，沸水浴15 min，冷卻至室溫，于490 nm處檢測其吸光度。按式(1)計算天麻多糖含量。

(1)

式中：

W——多糖含量，%；

C——多糖的葡萄糖濃度，mg/mL；

D——多糖稀釋倍數(shù)；

V——提取液體積，mL；

m——原料干重，g。

1.3.4 抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除：參照文獻(xiàn)[28]，修改如下：用無水乙醇配制成0.04 mg/mL DPPH溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。分別吸取70 μL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液和200 μL DPPH溶液于96孔酶標(biāo)板，27 ℃孵育10 min，每份樣品平行操作3次，在517 nm處用酶標(biāo)儀測定吸光值(A)；以去離子水70 μL和200 μL DPPH溶液的吸光度值作對照(A0)；空白為供試待測液70 μL和無水乙醇200 μL的吸光度值(B)；以不同濃度的Vc溶液作陽性對照。按式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

D——DPPH自由基清除率，%；

A——70 μL多糖溶液和200 μL DPPH溶液的吸光度值；

B——70 μL多糖溶液和200 μL無水乙醇的吸光度值；

A0——70 μL去離子水和200 μL DPPH溶液的吸光度值。

(2) ABTS自由基清除：參照文獻(xiàn)[29]配制ABTS工作液。參考文獻(xiàn)[30]并略作修改：將不同方法提取的天麻多糖配制成梯度濃度的樣品溶液，分別吸取30 μL多糖溶液、180 μL ABTS工作液于96孔酶標(biāo)板，37 ℃下孵育30 min。蒸餾水調(diào)零后，在734 nm處用酶標(biāo)儀測定其吸光度?？瞻滋幚恚?0 μL去離子水和180 μL ABTS工作液。每份供試樣品操作3次。以不同濃度的Vc溶液作陽性對照。按式(3)計算ABTS自由基清除率。

(3)

式中：

R——ABTS自由基清除率，%；

A1——30 μL多糖溶液與180 μL ABTS液的吸光度值；

A0——30 μL去離子水與180 μL ABTS液的吸光度值。

(3) FRAP鐵離子還原能力：參照文獻(xiàn)[31]配制FRAP工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。參照文獻(xiàn)[32]繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傔€原能力測定：吸取70 μL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液，加入200 μL 37 ℃預(yù)熱的FRAP工作液于96孔酶標(biāo)板，搖勻后，37 ℃反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在593 nm測定其吸光度值?？瞻诪楣┰囈喝軇┐婀┰囈杭尤隖RAP工作液。根據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4的濃度(μmol/L)為FRAP值。每個稀釋濃度做3次平行試驗，求平均值。以不同濃度的Vc溶液作陽性對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)處理及作圖均采用Microsoft Excel 2007進(jìn)行，利用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件對清除自由基活性數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析與顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法的天麻多糖提取率

由圖2可知，3種提取方法對天麻多糖提取率影響較大，彼此間差異均達(dá)到極顯著水平(P< 0.01)，其中酶法的提取率最高。

本試驗通過熱水浸提法提取多糖得率為22.380%，與宗露[33]對平武烏天麻多糖測定含量25.02%結(jié)果基本一致；超聲輔助提取法天麻多糖得率為33.089%，該結(jié)果與楊天友等[26]以超聲波輔助提取60目德江天麻粉末，多糖得率為33.4%結(jié)果一致；酶法提取天麻多糖得率為50.315%，遠(yuǎn)高于目前報道[34]的38.34%，可能與兩者所選材料有關(guān)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)圖2 不同提取方法天麻多糖提取率Figure 2 The extraction rates of polysaccharides from different extraction methods

2.2 不同提取方法所得粗多糖抗氧化活性的差異

2.2.1 DPPH自由基清除活性 由圖3可知，3種提取方法得到的天麻粗多糖與Vc的DPPH自由基清除活性存在較大差異。在2.5 mg/mL濃度下，酶法提取粗多糖的DPPH自由基清除率顯著高于同濃度其他2種提取方法的，但在4，5 mg/mL濃度下，超聲輔助提取粗多糖的DPPH自由基清除活性顯著高于其他提取方法的。在一定濃度范圍內(nèi)，3種提取方法得到的粗多糖對DPPH自由基清除率隨粗多糖濃度升高而升高，且存在一定的線性關(guān)系(見表1)，通過計算，熱水浸提、超聲輔助提取、酶法提取的多糖溶液和Vc溶液的DPPH自由基清除率的IC50分別為5.057，4.437，4.993，0.051 mg/mL。由于IC50值越小，多糖對DPPH自由基清除率越高，3種方法提取的粗多糖中，以

*表示在同濃度下與其他方法提取的多糖差異顯著(P<0.05)圖3 不同提取方法所得粗多糖對DPPH自由基清除能力

Figure 3 The DPPH free radical scavenge capacities of crude polysaccharides from different extraction methods

表1不同提取方法所得粗多糖及VC對DPPH自由基清除率的IC50

Table 1IC50of crude polysaccharides from different extraction methods and Vc on DPPH free radical scavenge capacities

樣品回歸方程R2IC50/(mg·mL-1)熱水浸提多糖y=7.566x+11.7400.8645.057超聲輔助提取多糖y=8.357x+12.9200.9584.437酶法提取多糖y=6.668x+16.7100.8084.993VCy=935.900x+2.0910.9800.051

超聲輔助提取的粗多糖對DPPH自由基清除率最高，其活性最強(qiáng)。這可能與超聲波強(qiáng)烈的機(jī)械剪切作用致多糖分子結(jié)構(gòu)改變有關(guān)[35]。

2.2.2 ABTS自由基清除活性 由圖4可知，不同提取方法提取的天麻粗多糖均表現(xiàn)出一定的ABTS自由基清除活性，在粗多糖濃度為5 mg/mL時，酶法提取的粗多糖ABTS自由基清除率最高 (47.449%)，與其他2種方法提取的粗多糖差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。此外，在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的量效關(guān)系(見表2)，且所有回歸方程的R2均>0.9，表明方程的擬合度很高。依據(jù)所得線性方程計算各多糖溶液的ABTS自由基清除率的IC50分別為6.130，5.406，4.917 mg/mL，陽性對照Vc對ABTS自由基清除率的IC50為0.040 mg/mL?？梢?，在ABTS抗氧化評價體系中，其活性順序是酶法提取粗多糖>超聲輔助提取粗多糖>熱水浸提粗多糖。唐小琴[36]研究發(fā)現(xiàn)酶提法提取的溫和條件能更好保全多糖的生物活性，本試驗同樣顯示酶法提取天麻多糖活性較高，可能與此有關(guān)。

*表示在同濃度下與其他方法提取的多糖差異顯著(P<0.05)圖4 不同提取方法所得粗多糖對ABTS自由基清除能力

Figure 4 The ABTS free radical scavenge capacities of crude polysaccharides from different extraction methods

表2不同提取方法所得粗多糖及VC對ABTS自由基

清除率的IC50

Table 2IC50of crude polysaccharides from different extraction methods and Vc on ABTS free radical scavenge capacities

樣品回歸方程R2IC50/(mg·mL-1)熱水浸提多糖y=7.417x+4.5340.9806.130超聲輔助提取多糖y=8.555x+3.7550.9595.406酶法提取多糖y=9.467x+3.4530.9724.917VCy=1069.000x-1.1100.9800.040

2.2.3 FRAP鐵離子還原能力 由圖5可知，在所測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各組粗多糖還原Fe3+的能力隨濃度的升高而增大，且呈現(xiàn)一定線性關(guān)系，所有線性回歸方程R2值均>0.960，表明方程的擬合度很高(表3)。在質(zhì)量濃度2.5 mg/mL時，超聲輔助提取的粗多糖還原Fe3+的能力顯著高于同濃度下其他提取法的；在質(zhì)量濃度3，4，5 mg/mL時，超聲輔助提取的粗多糖還原Fe3+的能力極顯著高于同濃度下其他提取法的?？傮w來看，超聲輔助提取的粗多糖還原Fe3+的能力最強(qiáng)，但各組粗多糖還原Fe3+的能力都較弱，均低于同濃度的陽性對照。

**表示在同濃度下與其他方法提取的多糖差異極顯著(P<0.01)； *表示在同濃度下與其他方法提取的多糖差異顯著(P<0.05)圖5 不同提取方法所得粗多糖的FRAP值Figure 5 FRAP values of crude polysaccharides from different extraction methods表3 不同提取方法所得粗多糖及VC對Fe3+還原能力的回歸方程

Table 3 The regression equations of crude polysaccharides from different extraction methods and Vc on Fe3+reducing capacity

樣品回歸方程R2熱水浸提多糖y=38.410x+6.0180.980超聲輔助提取多糖y=46.760x+2.7270.981酶法提取多糖y=38.020x+6.3280.990VCy=14179.000x-151.90.966

3 結(jié)論

不同提取方法對天麻多糖提取率及其抗氧化活性影響不同，其中酶法提取率最高，其次為超聲輔助提??；超聲輔助提取法和酶法提取均可保持天麻多糖高效的抗氧化活性。3種提取方法得到的天麻粗多糖與陽性對照Vc相比，抗氧化活性相對較低，但多糖作為生物大分子化合物，和Vc相同質(zhì)量濃度時，多糖物質(zhì)的量濃度顯著低于Vc。由此，天麻多糖也仍具有良好的抗氧化活性，可以作為一種抗氧化劑進(jìn)一步深入研究。

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EffectofdifferentextractionmethodsontheextractionratioandantioxidantactivityofpolysaccharidesfromGastrodiaelataBl.

In order to screen a suitable extraction method for polysaccharides fromGastrodiaelataBl., the hot water extraction, ultrasound extraction and enzymatic hydrolysis were applied to extracting polysaccharides fromG.elataBl.f.glaucaS. Chow from Pingwu in Sichuan province, then the polysaccharides extraction ratios and their antioxidant activities were compared. The polysaccharides extraction ratios and antioxidant activities were obviously influenced by the extraction methods. Of them, the extraction ratio of enzymatic hydrolysis was the highest with the value of 50.315%, which was extremely different from the other extraction methods (P<0.01). The antioxidant activities were in the following order: ultrasound extraction, enzymatic hydrolysis and hot water extraction by using DPPH free radical scavenge capacity and FRAP values. However, the antioxidant activities were in the following order: enzymatic hydrolysis, ultrasound extraction and hot water extraction by using ABTS free radical scavenge capacity. In conclusion, due to the higher extraction rate and antioxidant activity, ultrasound extraction and enzymatic hydrolysis were efficient to extract polysaccharides fromG.elata.

GastrodiaelataBl.; polysaccharides; hot water extraction; ultrasound extraction; enzymatic hydrolysis; antioxidant activities

四川省科技支撐計劃子課題(編號：2014SZ0131)

王慶，男，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

吳衛(wèi)(1970—)，女，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，博士。E-mail：ewuwei@sicau.edu.cn

2017—05—04

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.031