李大鵬 呂春雷 徐會斌 鄭文哲 王鳳嬌 張霞

短期快速失血對機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平影響的實(shí)驗(yàn)研究*

李大鵬 呂春雷 徐會斌 鄭文哲 王鳳嬌 張霞

目的 探討短期快速失血對機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平的影響。方法 選擇普通級新西蘭兔11只，通過急性失血方式建立收縮壓下降曲線，形成快速失血模型，測定收縮壓基礎(chǔ)值（T1），當(dāng)收縮壓降至基礎(chǔ)值2/3（T2）、基礎(chǔ)值1/2（T3）、基礎(chǔ)值1/3（T4）時采集血樣，采用酶聯(lián)免疫吸附分析檢測各位置血清丙二醛（malondialdehyde MDA）、過氧化氫酶（hydrogen peroxide enzyme CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione oxidation reductase GSH-PX）活性，并

予以統(tǒng)計分析。結(jié)果 MDA ：B組低于C組、C組低于D組，各時間水平間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；CAT ：A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，T1-T2、T2-T3、T3-T4各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GSH-Px ：A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，T1、T2間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 短期快速失血對機(jī)體抗氧化酶CAT、GSH-Px具有明顯影響，可致CAT、GSH-Px活性下降，而反映脂質(zhì)過氧化程度的MDA水平則上升，失血量與CAT、GSH-Px指標(biāo)間相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義。

失血 脂質(zhì)過氧化 丙二醛 抗氧化酶 過氧化氫酶 谷胱甘肽過氧化物酶 抗氧化能力

短期快速失血常見于院前急救及院內(nèi)救治，可引起失血性低血容量休克等急危重癥，導(dǎo)致組織低灌注、再灌注損傷等[1，2]。現(xiàn)選擇新西蘭兔為研究對象，通過急性失血方式形成收縮壓下降曲線，建立快速失血模型，以反映脂質(zhì)過氧化程度的丙二醛（malondialdehyde，MDA）和抗氧化能力的過氧化氫酶（hydrogen peroxide enzyme CAT）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneoxidation reductase GSH-PX）為監(jiān)測指標(biāo)，探討短期快速失血對機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平的影響，報告如下。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)對象 隨機(jī)選擇新西蘭兔（n=11），普通級，體重質(zhì)量2～3 kg，雌雄不限，購于山東省濟(jì)南實(shí)驗(yàn)動物中心（實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK（魯）2015-0001），普通環(huán)境中沖洗式飼養(yǎng)兔籠（蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備公司）內(nèi)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。

2 主要儀器與試劑 ZH-HX-2型無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）用于血流動力學(xué)指標(biāo)監(jiān)測，小動物人工呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技公司）用于輔助呼吸等。

測定MDA、CAT、GSH-Px的主要儀器包括722型光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠，MDA檢測波長532 nm、1 cm光徑比色杯，CAT檢測波長405 nm、0.5 cm光徑比色杯，GSH-PX檢測波長412 nm、1 cm光徑比色杯）、5810R臺式冷凍高速離心機(jī)（德國EPPendorf公司）等。測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

實(shí)驗(yàn)主要耗材：0.3%戊巴比妥鈉溶液（自配），肝素鈉注射液（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，批號1507104），0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號2015092407），一次性使用塑料血袋（四川南格爾生物科技有限公司，批號150304）等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 動物實(shí)驗(yàn)：新西蘭兔適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d以上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前24 h禁食，2～3 h禁水。實(shí)驗(yàn)操作前，實(shí)驗(yàn)兔均先稱重并記錄，并采集血標(biāo)本2 ml以上待檢（常規(guī)方法迅速分離血清，–80℃保存）。

選擇0.3%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為30 mg/kg體重，緩慢耳緣靜脈注射。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，麻醉過程中可逐步追加1/5量，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)呼吸暫停者給予輔助呼吸至自主呼吸恢復(fù)。麻醉穩(wěn)定后，將實(shí)驗(yàn)兔仰臥固定在解剖臺上，用8%硫化鈉脫毛暴露手術(shù)區(qū)皮膚后常規(guī)消毒，手術(shù)分離兔右側(cè)頸總動脈，完畢后插入肝素化動靜脈插管并用縫合線固定好，肝素化抗凝（500 U/kg），插管通過壓力轉(zhuǎn)換器與無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)相連，監(jiān)測血壓、心率等血流動力學(xué)指標(biāo)變化。無菌操作下，按以上方式分離出右側(cè)股動脈進(jìn)行P E套管插管并用縫合線固定好以建立放血通路，并與一次性使用塑料血袋（帶刻度定量收集管）相連，用于放血及血液標(biāo)本留取。

3.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽洌簩?shí)驗(yàn)操作前，記錄實(shí)驗(yàn)兔收縮壓基礎(chǔ)值（T1）等指標(biāo)。

選擇右側(cè)股動脈建立放血通路進(jìn)行放血，使用一次性使用塑料血袋收集，兔收縮壓隨放血量增加而逐步下降，形成收縮壓下降曲線。當(dāng)收縮壓降至基礎(chǔ)值2/3（T2）、1/2（T3）、1/3（T4）3個位置時，通過帶刻度定量收集管分別留取血標(biāo)本2 ml以上，按常規(guī)方法迅速分離血清，–80℃保存待檢。

4 指標(biāo)測定 嚴(yán)格按試劑盒操作說明書要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品處理和實(shí)驗(yàn)操作。MDA水平測定采用TBA法，532 nm波長測各孔吸光度A，檢測范圍為0.5～113 nmol/ml；CAT活性測定采用可見光法，405 nm波長測各孔吸光度A，檢測范圍為0.2～24.8 U/ml；GSH-PX活性測定采用DTND顯色法，412 nm波長測各孔吸光度A，檢測范圍為20～330 U/ml。

結(jié) 果

1 11只實(shí)驗(yàn)兔在T1～T4共4個位置采集血樣，檢測血清MDA、CAT、GSH-PX，分別按A、B、C、D進(jìn)行分組，A～D各組指標(biāo)分別進(jìn)行組間統(tǒng)計學(xué)分析。MDA、CAT、GSH-Px檢測結(jié)果見表1，其中MDA檢測B組低于C組、C組低于D組，CAT檢測A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組，GSH-PX檢測A組高于B組、B組高于C組、C組高于D組。

2 重復(fù)測量因素為時間因素，有T1、T2、T3、T4共4個水平。MDA、CAT、GSH-PX的檢測結(jié)果見表2；對重復(fù)效應(yīng)進(jìn)行方差分析（F檢驗(yàn)），結(jié)果見表3；采用LSD法進(jìn)行各時間水平間多重比較，結(jié)果見表4、5。

表1 各組MDA、CAT、GSH-Px檢測結(jié)果

表2 球型檢驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

表4 CAT不同時間水平下LSD多重比較結(jié)果

表5 GSH-PX不同時間水平下LSD多重比較結(jié)果

討 論

氧化應(yīng)激是在損傷因素作用下，機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增多和（或）清除能力降低，導(dǎo)致氧自由基在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積，出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化及造成細(xì)胞或組織氧化損傷[3，4]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，可間接反映細(xì)胞受自由基攻擊后脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度，以及間接反映氧自由基對細(xì)胞的損傷程度，MDA升高是機(jī)體氧自由基損傷標(biāo)志?？寡趸窩AT可有效清除自由基，減輕及阻斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，間接反映抗氧化酶的活性及機(jī)體清除自由基的能力；GSH-PX可還原體內(nèi)不斷生成的脂質(zhì)過氧化物和過氧化氫，減少活性氧自由基及脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生，防止脂質(zhì)過氧化物對機(jī)體組織造成損害[5-9]。

本文實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：短期快速失血中隨失血量增加，CAT組間比較T1-T2、T2-T3、T3-T4各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GSH-Px組間比較T1、T2間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明失血增加對CAT、GSH-Px指標(biāo)具有明顯影響，失血量與CAT、GSH-Px指標(biāo)的相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義，提示失血致機(jī)體氧自由基生成增多，過量自由基水平致CAT、GSH-Px消耗增加及活性顯著下降，導(dǎo)致清除自由基能力及抗氧化能力下降；MDA組間比較各時間水平間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），MDA水平上升，表明快速失血對MDA指標(biāo)具有一定影響，使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)上調(diào)，促進(jìn)并導(dǎo)致機(jī)體生物膜損傷。

通過急性失血方式建立快速失血模型，以反映脂質(zhì)過氧化程度的MDA和抗氧化能力的CAT及GSH-PX指標(biāo)監(jiān)測，研究快速失血對脂質(zhì)過氧化水平的影響，數(shù)據(jù)表明短期快速失血對CAT、GSHPx指標(biāo)具有明顯影響，可降低血清CAT、GSH-Px活性，致MDA水平上升但無明顯影響，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)上調(diào)，相關(guān)資料為院前及院內(nèi)失血救治及相關(guān)研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。今后有待于進(jìn)一步增加實(shí)驗(yàn)研究數(shù)量，并在臨床救治等工作中加以推廣。

1 李維礁，陳媛，朱瑋亞，等.家兔急性失血性休克及分組治療的血壓、微循環(huán)同步觀測[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，32（5）：20-23.

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Experimental Study on the Change of Organism Lipid Peroxidation Level in Short Term Rapid Blood loss

LI Dapeng，LV Chun-lei，XU Hui-bin，et al. The 88th Hospital of PLA，Taian 271000

Objective Study on the changes of organism lipid peroxidation level in short term rapid blood loss.Methods The rapid blood loss model of the gradient decerease in the systolic blood pressure was eatablished in 11 new zealand rabbits on ordinary level. The arterial blood during the different phase of shock，i.e.when the systolic pressures were 2/3（T2），1/2（T3），1/3（T4）of the basis systolic blood pressure，was collected and malondialdehyde（MDA）、hydrogen peroxide enzyme （CAT）、glutathione oxidation reductase （GSH-P x）levels in the plasma were determined by the double antibody sandwich method of enzyme-labeled immunosorbent assay（ELISH），and the data be statistically analyzed. Results MDA ：Group B less than in group C，group C less than in group D，there was no significant difference between the time level（P＞0.05）. CAT ：Group A higher than in group B，group B higher than in group C，group C higher than in group D，there was no significant difference between the T1-T2，T2-T3，T3-T4（P＞0.05），there were significant differences between the other groups （P＜0.05）. GSH-Px ：Group A higher than in group B，group B higher than in group C，group C higher than in group D，there was no significant difference between the T1-T2（P＞0.05），there were significant differences between the other groups （P＜0.05）.Conclusion Short term rapid blood loss has a significant effect on the antioxidant enzyme CAT and GSH-Px of organism，can lead to significantly decrease in CAT and GSH-Px activity，MDA levels rise reflect the degree of lipid oxidation. There were significantly correlated between blood loss and CAT，GSH-Px index.

Lose blood Lipid peroxidation Malondialdehyde Antioxidant enzyme Hydrogen peroxide enzyme Glutathione oxidation reductase Antioxidant capacity

R446.11

A

1671-2587（2017）05-0430-04

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.005

*本課題受軍隊(duì)“十二五”后勤科研計劃項(xiàng)目（No.CWS11J297）資助

271000 山東省泰安市解放軍第88醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

李大鵬（1964–），男，遼寧錦州人，副主任技師，主要從事醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)工作，（E-mail）lidapeng1964@126.com。

呂春雷，男，主任醫(yī)師，（E-m a i l）15653808901@163.com。

2017-06-02）

（本文編輯：王虹）