嚴棟梁　陳杰　葛創(chuàng)　錢益　朱斌　邵偉斌

【摘要】 目的：觀察不同劑量川芎嗪對刀豆蛋白A誘導的小鼠肝纖維化TNF-α、IL-6、IL-10表達的影響。方法：BALB/C小鼠隨機分為5組，正常對照組（A組）10只；ConA模型（B組）15只；川芎嗪低劑量（100 mg/kg）組（C組）15只；川芎嗪中劑量（200 mg/kg）組（D組）15只，川芎嗪高劑量（800 mg/kg）組（E組）15只。采血及留取肝組織，HE法檢測肝組織病理變化，ELISA法檢測血清中腫瘤壞死因子（TNF-α），IL-6的水平，RT-qPCR檢測肝組織中 IL-6、IL-10的表達。結(jié)果：刀豆蛋白A模型組小鼠肝纖維化明顯，TNF-α、IL-6的表達明顯增多，IL-10的表達明顯減少，與其他組比較有差異顯著（P<0.05）；不同劑量的川芎嗪治療干預后，肝纖維化減輕，伴TNF-α、IL-6表達下降，IL-10的表達增加，與刀豆蛋白A模型組比較差異明顯（P<0.05），尤以高劑量組為著。結(jié)論：川芎嗪對刀豆蛋白A誘導的小鼠肝纖維化有保護作用，有劑量相關(guān)性，其機制可能與減少細胞凋亡的發(fā)生和通過抑制JAK-STATs信號通路的激活有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 川芎嗪； 刀豆蛋白A； 肝纖維化； TNF-α； IL-6

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.19.006

肝纖維化在國內(nèi)常是病毒性肝炎慢性進展的結(jié)果，其發(fā)生機制仍不完全清楚，特別是治療和預防是困擾臨床的難題[1-2]。肝纖維化動物模型很多，其中刀豆蛋白A（ConA）誘導的小鼠肝纖維化模型所造成的肝細胞損傷與和人病毒性肝炎的免疫機制相似，具有臨床實用性[3]。川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是從中藥川芎中分離提純的生物堿單體，具有活血化瘀、抗血小板凝集、擴張血管等多種作用[4]，臨床應(yīng)用廣泛。近年來有動物實驗顯示川芎嗪可能降低肝纖維化大鼠肝臟膠原蛋白水平，使肝纖維化延緩形成[5]。本文應(yīng)用刀豆蛋白A（ConA）小鼠實驗性肝纖維化模型，檢測川芎嗪對肝組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10表達的影響，以期進一步闡明川芎嗪抗肝纖維化的可能作用機理，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/C小鼠70只，雌雄不拘，7～9周齡，體重17～23 g，購自南通大學實驗動物中心。所有小鼠飼養(yǎng)于南通大學實驗動物中心，室溫22 ℃，相對濕度55%，12 h晝夜節(jié)律，自由進食、飲水，適應(yīng)環(huán)境2周后開始實驗。

1.1.2 主要試劑 川芎嗪片50 mg/片（麗珠集團利民制藥廠生產(chǎn)，批號：140306）；刀豆蛋白A（Sigma Aldrich 公司）；H&E染色試劑盒G1120（北京索萊寶公司）；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（USCN公司）；小鼠白介素6（IL-6）ELISA試劑盒（USCN公司）

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 BALB/C小鼠隨機分為5組，正常對照組（A組）10只；ConA模型（B組）15只；川芎嗪低劑量（100 mg/kg）組（C組）15只；川芎嗪中劑量（200 mg/kg）組（D組）15只，川芎嗪高劑量（800 mg/kg）組（E組）15只。8周試驗結(jié)束時B組小鼠死亡7只，C組小鼠死亡6只，D組小鼠死亡3只，E組小鼠死亡2只。

1.2.2 實驗及給藥方法 模型組和實驗組均通過小鼠的尾靜脈注射刀豆蛋白（10 mg/kg），2次/周，共8周，正常對照組則注射等量生理鹽水。實驗組分別按低劑量組川芎嗪100 mg/kg，中劑量組川芎嗪200 mg/kg，高劑量組川芎嗪800 mg/kg，給藥方法為每天灌胃給藥。實驗結(jié)束后，眼眶采血法留取血清并處死小鼠，取出肝臟組織，一部分用10%福爾馬林固定用于HE染色，一部分肝臟組織用于RT-qPCR分析。

1.3 觀察指標和測定方法

1.3.1 肝臟組織染色 取不同組小鼠肝臟，10%甲醛的PBS溶液固定，脫水，石蠟包埋，5 μm組織切片，按常規(guī)進行HE染色，中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察組織學改變及炎癥細胞浸潤。

1.3.2 ELISA檢測小鼠血清TNF-α、IL-6的表

達 取血，放置30 min后，離心10 min （3500 r/min），所取得的血清用于TNF-α含量測定。取試劑盒中已經(jīng)用小鼠單抗包被、封閉好的96孔板條，加入樣品或不同濃度的標準品100μL，37 ℃孵育90 min后，甩盡孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液350 μL，靜置30 s后甩盡液體，拍干。洗滌板條4次后，加入檢測劑工作液100 μL（內(nèi)含生物素化的抗小鼠TNF-α抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素），37 ℃孵育60 min后，洗滌板條4次，然后加入顯色劑溶液（100 μL/孔），避光，37 ℃，15～20 min。若反應(yīng)孔中有小鼠TNF-α，則辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑顯蘭色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值，通過標準曲線求出樣品中TNF-α濃度。IL-6 ELISA檢測參照上述步驟進行。

1.3.3 RT-qPCR檢測小鼠肝組織中IL-6和IL-10的mRNA表達 收集肝臟細胞，加入1 mL TRIzol裂解液，反復吹打至細胞充分裂解，按說明書提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測量濃度后取1 μg按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴增。PCR的擴增條件為93 ℃ 2 min預變性；然后按93 ℃ 45 s、55 ℃ 60 s，10個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性分析后組間分析使用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果endprint

2.1 肝臟大體標本觀察 各組肝組織大體標本觀察顯示：A組大鼠肝臟光澤紅潤，包膜光整，質(zhì)地柔軟；與A組相比，B、C組大鼠肝臟色澤暗淡，表面凹凸不平，質(zhì)地較硬；D、E組外觀相對光滑，光澤暗紅，質(zhì)地介于A組和B組之間。

2.2 肝臟病理學檢查 肝組織HE染色結(jié)果顯示，A組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列規(guī)則，小葉內(nèi)無細胞變性，無炎性細胞浸潤（圖1A）；B組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，可見明顯纖維間隔形成（圖1B）；C組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，可見明顯纖維間隔形成（圖1C）；D組仍可見菲薄的纖維條索及少量炎細胞浸潤（圖1D）；E組肝纖維化程度明顯減輕，鏡檢結(jié)果與A組相近（圖1E）。

2.3 不同劑量川芎嗪對血清TNF-α、IL-6表達的影響（ELISA法） 由圖2可見，與A組比較，B組TNF-α表達明顯增加（P<0.001），100、200、800 mg/kg川芎嗪可抑制血清TNF-α的表達，隨藥物濃度增大，TNF-α的抑制值增大，中劑量組和高劑量組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。不同劑量的川芎嗪均可減少IL-6的表達，尤以高劑量組的IL-6表達最少（P<0.001）。

2.4 不同劑量川芎嗪對肝組織IL-6、IL-10表達的影響（QPCR法） 由圖3可見，100、200、800 mg/kg

川芎嗪可抑制肝組織中IL-6的表達，隨藥物濃度增大，肝組織中IL-6的表達減少更明顯（P<0.05）。不同劑量的川芎嗪均可使得肝組織中IL-10的表達增加，尤以高劑量組的IL-10表達最多（P<0.01）。

3 討論

肝星狀細胞（Hepatic stellate cell，HSC）的持續(xù)性活化，此后合成大量膠原為主的細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM），是肝纖維化發(fā)生的病理基礎(chǔ)[6-7]。現(xiàn)認為，活化的HSC有兩個去向，由活化狀態(tài)轉(zhuǎn)回靜止狀態(tài)或發(fā)生細胞凋亡。研究顯示，很多細胞因子、相關(guān)基因和蛋白都參與在纖維化的過程中，形成一個復雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[8]。因此，逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程最重要的就是能夠HSC活化，核心途徑是發(fā)現(xiàn)能夠靶向抑制HSC增殖及促進HSC凋亡的藥物。

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是作用強大的致炎因子，主要由單核巨噬細胞、肝星狀細胞及枯否細胞等產(chǎn)生，可誘導包括自身在內(nèi)的多種致纖維化、致炎因子產(chǎn)生，與其他細胞因子等形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，對肝纖維化的啟動及調(diào)控起重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子TNF-α在ConA性誘導的小鼠肝纖維化中發(fā)揮了極為重要的作用，大量CD4+T細胞與巨噬細胞活化是產(chǎn)生TNF-α的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。在此模型中細胞因子TNF-α可能是直接啟動了細胞凋亡的信號造成了肝細胞凋亡的發(fā)生。同時，TNF-α是激活HSC持續(xù)活化的核心細胞因子，也能加強HSC的趨化性，促進HSC增生。TNF-α可能增加肝臟組織的炎癥反應(yīng)而加重肝纖維化的發(fā)生。筆者實驗研究結(jié)果顯示，應(yīng)用中、高劑量川芎嗪干預的治療組TNF-α水平較模型組和低劑量組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示川芎嗪的抗纖維化作用可能是通過調(diào)節(jié)TNF-α來抑制細胞凋亡的發(fā)生和減緩肝纖維的啟動。

IL-6在炎癥反應(yīng)中有核心作用，能加速肝臟細胞的炎性反應(yīng)，也能通過激活細胞因子的級聯(lián)反應(yīng)從而介導肝細胞損傷的發(fā)生[11]。研究表明，IL-6可激活JAK-STAT信號通路中的STAT1和STAT3，引發(fā)慢性炎癥，導致肝臟的病理生理改變。JAK2/STAT3信號通路是一條多種細胞因子共用的信號傳導途徑，廣泛參與機體組織器官的細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過程[12-14]。研究表明，這一信號通路在機體組織器官的纖維化過程中也發(fā)揮了重要作用[15-16]。因此，肝組織內(nèi)IL-6水平的升高可能是造成肝纖維化發(fā)生的始動因素。

IL-10主要由肝細胞及HSC、肥大細胞、肝巨噬細胞等產(chǎn)生，在抗炎癥反應(yīng)中有重要作用。IL-10可以有效抑制促纖維化因子TGF-β1的產(chǎn)生，抑制巨噬細胞合成分泌TNF-α，可以下調(diào)TNF-α下游效應(yīng)物NF-kB表達，還可以重構(gòu)細胞外基質(zhì)，可能通過促進膠原蛋白酶基因表達及下調(diào)Ⅰ型膠原的合成實現(xiàn)的[17-18]，因此IL-10具有減緩器官纖維化發(fā)生的功能[19]。有實驗表明，IL-10水平的絕對或相對不足不能有效抑制促炎和促纖維化因子合成與表達，導致肝細胞損害加重，病情惡化，間接證明IL-10對肝炎肝硬化細胞損害具有保護作用，且可能與肝臟損害程度呈平行關(guān)系[20]。

本研究顯示，B組大鼠肝組織纖維化程度明顯高于A組，且肝組織中TNF-α、IL-6的表達也明顯增加，IL-10表達減少；應(yīng)用中、高劑量川芎嗪后，D、E組的肝組織纖維化程度降低，同時肝組織中TNF-α、IL-6的表達減少，而IL-10表達增加，這三者均可能參與調(diào)控和抑制肝纖維化形成。

本研究的結(jié)果證實川芎嗪對刀豆蛋白A實驗性肝纖維化模型具有較為明顯的抗纖維化作用，其可能的機制是調(diào)控TNF-α、IL-6，IL-10的表達，減少細胞凋亡的發(fā)生和通過抑制JAK-STATs信號通路的激活等多環(huán)節(jié)、多靶點的來發(fā)揮作用，具體作用機制待進一步深入研究。

參考文獻

[1] Ellis E L，Mann D A. Clinical evidence for the regression of liver fibrosis[J].Journal of Hepatology，2012，56（5）：1171-1180.

[2] Jiao J，F(xiàn)riedman S L，Aloman C.Hepatic fibrosis[J].Current Opinion in Gastroenterology，2009，25（3）：223.

[3]陳麗，譚友文，葉云，等.刀豆蛋白A誘導小鼠肝纖維化動物模型的建立及機制探討[J].肝臟，2012，17（4）：250-260.endprint

[4]胡國芬，王建平.川芎嗪的藥理作用及臨床應(yīng)用進展[J].中國藥物與臨床，2006，6（10）：773-774.

[5]杜麗娟，徐軍全，宋彬妤，等.川芎嗪對CCl-4誘導的肝纖維化大鼠肝組織Nrf2/ARE信號通路的影響[J].中國實用醫(yī)藥，2014，9（9）：7-8.

[6] Bataller R，Brenner D A.Liver fibrosis[J].Journal of Clinical Investigation，2005，115（2）：209-218.

[7] Puche J E，Saiman Y，F(xiàn)riedman S L.Comprehensive Physiology：Hepatic Stellate Cells and Liver Fibrosis[M].America：John Wiley & Sons，2007：1728-1734.

[8] Troeger J S，Mederacke I，Gwak G Y，et al.Deactivation of Hepatic Stellate Cells during Liver Fibrosis Resolution in Mice[J].Gastroenterology，2012，143（4）：1073-1083.

[9] Pinzani M，Marra F，Carloni V.Signal transduction in hepatic stellate cells[J].Liver，1998，18（1）：2-13.

[10] Wolf D，Hallmann R，Sass G，et al.TNF-alpha-induced expression of adhesion molecules in the liver is under the control of TNFR1-relevance for concanavalin A-induced hepatitis[J].

J Immunol，2001， 166（2）：1300-1307.

[11] Wallis R S.Biologics and infections： lessons from tumor necrosis factor blocking agents[J].Infectious Disease Clinics of North America，2011，25（4）：895-910.

[12] Jatiani S S，Baker S J，Silverman L R，et al.JAK/STAT pathways in cytokine signaling and myeloproliferative disorders：Approaches for targeted therapies[J].Genes Cancer，2010，1（10）：979-993.

[13] Matsui F，Meldrum K K.The role of the Janus kinase family/signal transducer and activator of transcription signaling pathway in fibrotic renal disease[J].J Surg Res，2012，178（1）：339-345.

[14] Seavey M M，Dobrzanski P.The many faces of Janus kinase[J].Biochem Pharmacol，2012，83（9）：1136-1145.

[15] Mair M，Blaas L，?sterreicher C H，et al.JAK-STAT signaling in hepatic fibrosis[J].Frontiers in Bioscience，2011，16（2）：2794-2811.

[16] Lakner A M，Moore C C，Gulledge A A，et al.Daily genetic profiling indicates JAK/STAT signaling promotes early hepatic stellate cell transdifferentiation[J].World Journal of Gastroenterology，2010，16（40）：5047-5056.

[17] Chen Y X，Huang Y H，Zheng W D，et al.Interleukin-10 gene modification attenuates hepatocyte activation of rat hepatic stellate cells in vitro[J].Molecular Medicine Reports，2013，7（2）：371-378.

[18]涂云忠，張堅，劉慧萍，等.白細胞介素10基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞抑制大鼠肝纖維化形成的實驗研究[J].中華肝臟病雜志，2012，20（12）：908-911.

[19] Hsieh H G，Huang H C，Lee F Y，et al.Kinetics of cytokine expression in cirrhotic rats[J].Journal of the Chinese Medical Association Jcma，2011，74（9）：385.

[20]王小眾，張莉娟.IL-10抗肝纖維化的實驗研究及臨床現(xiàn)狀[J].世界華人消化雜志，2007，15（23）：2469-2472.

（收稿日期：2017-05-19） （本文編輯：周亞杰）endprint