曹長春　馬紅霞　楊迪

【摘要】 目的：分析探討經(jīng)介入途徑多療法、多基因聯(lián)合治療肝癌的可行性。方法：選取2013年11月-2016年11月120只大白兔建立肝癌模型，按照隨機數(shù)字表法分為五組，每組24只。第一組為單純超液化碘油栓塞組，第二組為超液化碘油+P53（質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物）組，第三組為超液化碘油+TK/CD（濃縮的TK-CD逆轉錄病毒上清），第四組為超液化碘油+P53+TK/CD組，第五組僅進行生理鹽水治療（對照組）。對五組大白兔進行常規(guī)的病理檢查和生存期觀測。結果：各治療組腫瘤體積增長率均較對照組明顯下降，其中第四組腫瘤增長率抑制最為有效，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；對照組瘤兔介入術后20～40 d相繼全部死亡，治療組在觀察期內(nèi)自然死亡30只（31.3%），第一組12只（50.0%），第二組9只（37.5%），第三組7只（29.2%），第四組2只（8.3%），五組瘤兔生存情況比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：介入基因療法能夠克服介入治療的副作用，有效地抑制腫瘤的生長，延長瘤兔的生存時間。

【關鍵詞】 介入； 多基因； 肝癌； 可行性

Feasibility Analysis of Combined Therapy and Multiple Gene Therapy for Hepatocellular Carcinoma/CAO Chang-chun，MA Hong-xia，YANG Di.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：029-032

【Abstract】 Objective：To investigate the feasibility of combined therapy and multiple gene therapy in the treatment of liver cancer.Method：A total of 120 rabbits from November 2013 to November 2016 were selected to establish the model of liver cancer，and they were randomly divided into 5 groups according to random number table method，24 cases in each group.The first group was given pure lipiodol embolization group，the second group was given lipiodol+P53（plasmid liposome complex） group，the third group was lipiodol+TK/CD（TK-CD retrovirus supernatant concentration），the fourth group was given lipiodol+P53+TK/CD group，the fifth group only saline the treatment （control group）.Five groups were examined by routine pathology and their lifetime were observed.Result：Compared with the control group，the tumor volume growth rate of the other groups decreased significantly，the fourth group was the most effective，the differences were statistically significant（P<0.05）.Rabbits of the control group had all died after PCI 20-40 days，natural death of the other groups in the observation period was 30 cases（31.3%），the first group was 12 cases（50.0%），the second group 9 cases（37.5%），the third group was 7 cases（29.2%），the fourth group was 2 cases（8.3%），the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Interventional gene therapy can overcome the side effects of interventional therapy，effectively inhibit the growth of tumor and prolong the survival time of tumor rabbits.

【Key words】 Intervention； Polygene； Liver cancer； Feasibility

First-authors address：The First Peoples Hospital of Lanzhou，Lanzhou 730050，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.008

肝癌（HCC）在世界惡性腫瘤中排名第五，是繼胃癌、食管癌之后引起死亡的第三大原因[1]。我國是肝炎大國，肝癌的發(fā)病率世界上最高，患者在初期時癥狀不明顯，大部分患者就診時已經(jīng)為晚期，主要表現(xiàn)為乏力、黃疸、肝區(qū)疼痛、腹水等，出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)時大部分已經(jīng)不能夠進行手術，其他的治療方法效果不理想，而且預后較差[2]。目前治療肝癌的眾多方法中手術仍舊為首選的方式，復發(fā)率較高，因此肝癌治療的關鍵為有效的抑制復發(fā)[3]，近年來基因治療的研究取得了很大成果，是繼化療、放療、手術、免疫治療之后的第五種治療方式，是最具有潛力的方法之一。為了進一步研究介入途徑多療法和多基因聯(lián)合治療肝癌的可行性，特選取本院120只大白兔進行研究，現(xiàn)報道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 選取2013年11月-2016年11月6～8個月120只新西蘭大白兔建立肝癌模型，體重2.0～2.5 kg，平均（2.23±0.53）kg，按照隨機數(shù)字表法分為五組，每組24只。實驗中使用的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、5-氟胞嘧啶、丙氧鳥苷分別由Gibco公司、Sigma公司、Roch Syntex公司生產(chǎn)，pCMV-p53質(zhì)粒、PA317細胞、PA317/TK-CD細胞由山東大學生物化學與分子生物學研究所贈。使用的主要設備為德國西門子公司的大C臂DSA和64排CT機。第一組為單純超液化碘油栓塞組，第二組為超液化碘油+P53（質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物）組，第三組為超液化碘油+TK/CD（濃縮的TK-CD逆轉錄病毒上清），第四組為超液化碘油+P53+TK/CD組，第五組僅進行生理鹽水治療（對照組）。

1.2 實驗方法 （1）通過擴增、提取、純化等制備pCMV-P53質(zhì)粒-脂質(zhì)體復合物，將提取后的pCMV-P53質(zhì)粒在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳需要8 V/cm電壓1 h，之后進行EB染色30 min并在紫外透視儀下觀察結果。為保證轉染效率最高，本次研究按照P53質(zhì)粒與脂質(zhì)體以1∶2比例混合。（2）制備濃縮的TK-CD逆轉錄上清，所用PA317/TK-CD為轉染pWZLneoT-KglyCD質(zhì)粒（為TKcDNA及CDcDNA的復制缺陷型逆轉錄病毒表達載體）的穩(wěn)定產(chǎn)病毒細胞，復蘇PA317細胞以及PA317/TK-CD細胞，將得到純化的PA317/TK-CD細胞大量培養(yǎng)，傳代。為去除細胞碎片應收集病毒上清液并離心5 min，過濾后加入多聚賴氨酸至終濃度0.005%，混均，4 ℃孵育5 min。在4 ℃條件下以20 000 r/min離心，2 h后去掉上清，用少量培養(yǎng)基重融病毒顆粒沉淀得到濃縮病毒。（3）細胞建立大白兔肝癌模型需要將瘤細胞加重在兔大腿內(nèi)側腹股溝部位的皮下，使其成瘤并傳代，瘤體長至1～2 cm3大約需要2周時間，手術取出代瘤株并剝落腫瘤包膜，剔除干凈壞死及纖維組織，取魚肉樣腫瘤組織在平皿剪成1～2 mm3的小塊，用生理鹽水反復沖洗后作為瘤種備用。（4）對預接種兔進行麻醉和固定，以倒V樣小弧形切口打開腹腔，打開部位為劍突下正中，檢出劍突并使用小拉鉤牽引暴露肝臟。用大小合適的瞼板腺囊腫鑷在擬接種的部位夾持肝葉并拖出腹腔外，夾持的力量為阻斷局部血流循環(huán)的力度，調(diào)整并固定螺絲。刺破肝包膜，深度約為4 cm，注入1瘤塊后封閉窗口，封閉可使用小塊的明膠海綿并在表面涂OB膠，待凝固后撤出瞼板腺囊腫鑷。將肝臟還原腹腔并縫合切口，手術后給予80萬單位的青霉素肌肉注射3 d。（5）手術后2周進行試驗，通過CT掃面選取腫瘤直徑為2 cm的荷瘤兔120只隨機分為五組，使用經(jīng)股動脈-肝動脈插管法，首先將實驗兔麻醉并固定，切開靠近腹股溝區(qū)股動脈縱行的皮膚，剪開股動脈稍分離股動脈，遠端用4號線穿過。將近絲線端提起阻斷血流，在股動脈前壁剪一小“V”插入短導絲，沿導絲插入自制導管鞘并結扎固定。用3F微導管尋找腹腔動脈進行造影，確認肝固有動脈后行選擇性插管，再次造影，證實肝實質(zhì)顯影需進一步對肝左或肝右動脈進行造影，插管成功后進行數(shù)字減影造影（使用優(yōu)維顯300為血管對比劑）并在透視監(jiān)視下緩慢的灌注試驗藥品。第一組每只注入1 mL的超液化碘油，第二組每只按順序經(jīng)導管注入1 mL超液化碘油和20 ?g的P53質(zhì)粒轉染液，第三組每只按順序經(jīng)導管注入1 mL超液化碘油和103 PFU的TK/CD濃縮病毒，第四組每只按順序經(jīng)導管注入1 mL超液化碘油、20 ?g的P53質(zhì)粒轉染液、103 PFU的TK/CD濃縮病毒，第五組經(jīng)導管于腫瘤供血動脈注入1 mL的生理鹽水。介入操作后沖洗導管（使用1 mL肝素鹽水），拔出鞘管、導管并進行結扎和縫合。術后預防感染可注射80萬單位青霉素，飼養(yǎng)環(huán)境需保證無菌和清潔。

1.3 觀察指標 對五組進行常規(guī)病理檢查（術前和術后進行B超和CT掃描計算腫瘤體積=最大直徑×最小直徑2/2，腫瘤生長率=治療后體積/治療前體積）和生存期觀測[4]。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 瘤兔治療前后的肝臟腫瘤生長體積和生長率 各治療組治療前瘤體所差無幾（P>0.05）；治療后前四組腫瘤體積增長率均較對照組明顯下降，其中第四組腫瘤增長率抑制最為有效，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 瘤兔生存期比較 此次試驗成功建立了兔肝癌模型，整個實驗過程插管以及介入治療順利，無死亡。肉眼觀察腫瘤組織呈現(xiàn)灰白色圓形或橢圓形結節(jié)樣，與周圍的分界較為清晰，剖面呈現(xiàn)出魚肉狀，中央大多數(shù)具有液化性壞死灶并形成囊腔。光鏡下發(fā)現(xiàn)切片中看不見正常的肝小葉結構，腫瘤呈明顯的異型性和浸潤性生長，較多核分裂相，呈現(xiàn)片狀或巢狀排列。對照組瘤兔介入術后20～40 d相繼全部死亡，治療組在觀察期內(nèi)自然死亡30只（31.3%），第一組12只（50.0%），第二組9只（37.5%），第三組7只（29.2%），第四組2只（8.3%），五組瘤兔生存差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病原因和機制尚不十分明確，至今仍然使用傳統(tǒng)的手術治療、放療和化療等手段治療肝癌，特別是中晚期患者療效不是特別滿意。經(jīng)過研究人們逐漸認識到腫瘤的生長和轉移與血管的生長有著密切的關系，腫瘤基因治療是目前研究的熱點，關鍵是尋找目的基因和探索多基因聯(lián)合治療，以獲得最佳的治療效果。腫瘤免疫學認為惡性腫瘤是惡性轉化細胞逃避了機體的免疫監(jiān)視而快速的生長，而免疫逃逸的機制十分復雜，與機體的免疫功能、腫瘤細胞的抗原調(diào)變等均有很大關系[5]。機體免疫監(jiān)視涉及特異性免疫、非特異性免疫、體液免疫、細胞免疫等多種免疫成分，相互協(xié)作殺傷腫瘤細胞。一般認為抗腫瘤免疫的主要方式是細胞免疫，特異性效應細胞是T細胞，但是在發(fā)揮殺傷腫瘤細胞時會受到腫瘤細胞MHC限制。自殺基因是目前研究的熱點，雙自殺基因療法通過整合兩種自殺基因并轉導入腫瘤細胞并表達融合基因產(chǎn)物，此產(chǎn)物具有兩種自殺基因編碼的酶活性，在此基礎上進行雙前體藥物治療可以發(fā)揮雙功能的殺傷作用，使腫瘤對于兩種雙前體的藥物更加敏感，具有高效、安全、廣譜、不易出現(xiàn)耐藥的優(yōu)勢[6-9]。在眾多自殺基因的體系中，對TK基因和CD基因的研究較為深入并且取得了確切的效果，而TK、CD上自殺基因的融合在更安全、更高效、更廣譜、不易產(chǎn)生耐藥性的同時可以減少藥物的劑量。雙自殺基因最為突出的特點為“旁觀者效應”，明顯擴大了殺傷作用，克服了轉導率低的缺點，效應更為強大，發(fā)揮出更大的抑癌效果。P53基因分為兩種類型（突變型和野生型），大部分肝癌患者存在基因突變，突變型喪失了抑癌活性轉為原癌基因，因此P53缺失或失活可導致化療敏感性降低和耐藥性出現(xiàn)，野生型主要是參與細胞內(nèi)的DNA修復和誘導細胞凋亡，提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[10]。在應用基因治療時，首先轉染的基因應該具有一定的表達效率，其次要注意為了方便最大限度的殺傷腫瘤細胞導入的基因要局限于靶細胞，而不會損傷正常的細胞[11-12]。因此，基因治療的關鍵就為提高靶向轉染的效率和解決靶向性基因轉移技術[13]。通過接入的方式直接將基因導入腫瘤組織還能夠減輕毒副作用，降低對正常肝細胞的轉染，可以作為基因治療的理想給藥方法及途徑[14]。endprint

本研究結果顯示，各治療組腫瘤體積增長率均較對照組明顯下降，其中第四組腫瘤增長率抑制最為有效，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），對照組瘤兔介入術后20～40 d相繼全部死亡，治療組在觀察期內(nèi)自然死亡30只（31.3%），第一組12只（50.0%），第二組9只（37.5%），第三組7只（29.2%），第四組2只（8.3%），五組瘤兔生存差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。本研究引入野生型P53基因發(fā)揮出正常抑癌功能的同時也加強了雙自殺基因的效能，基因治療與碘油栓塞相結合加劇了腫瘤內(nèi)部缺氧的環(huán)境，延長基因治療的作用，從而抑制腫瘤的生長達到延長生存期的效果[15]。介入技術是一種易操作的、微創(chuàng)的、理想的基因施放方法，導管應該能夠將攜帶目的基因的載體投放到準確的部位，基因的轉染僅限于所在的細胞內(nèi)，最大限度的減少隨血流流入遠端部位而減輕基因治療的不良反應[16-17]。介入醫(yī)學的飛速發(fā)展在許多疾病的診斷和治療中都占據(jù)著重要的作用，因此需要介入放射醫(yī)生對基本原理和治療的策略熟悉掌握，積極的投身基因治療的臨床試驗中[18]。無論是腫瘤內(nèi)灌注還是影像引導下的瘤內(nèi)直接注射都是介入醫(yī)學范疇，因此可見介入醫(yī)學是基因導入的理想方法，并伴隨肝癌的基因治療逐步應用于臨床并起到積極作用[19]。通過前期的研究已經(jīng)證實了P53基因和TK、CD雙自殺基因在腫瘤細胞內(nèi)的轉染和表達的情況，基因療法主要通過靜脈給藥和瘤體內(nèi)注射，相應的表達說明介入途徑導入基因有效可行，為理想的給藥方法和途徑[20]。

綜上所述，介入多療法、多基因聯(lián)合治療能夠克服介入治療的副作用，有效地抑制腫瘤的生長，延長瘤兔的生存時間。

參考文獻

[1]郝蒙茹，黃承浩，夏寧邵.HSV-1溶瘤病毒在腫瘤治療研究中的新進展[J].病毒學報，2016，32（4）：516-522.

[2] Oishi N，Wang X W.Novel therapeutic strategies for targeting liver cancer stem cells[J].Int Biol Sci，2011，7（5）：517-535.

[3] Broker M E，Ijzermans J N，Witjes C D，et al.The predictive value of Golgi protein 73 in differentiating benign from malignant liver tumors[J].PLoS One，2014，9（7）：e 100 187.

[4]譚曉華.溶瘤腺病毒腫瘤靶向治療：從實驗室到臨床[J].中國腫瘤生物治療雜志，2012，19（6）：569-576.

[5]侯毅斌，劉琦，段光峰，等.彌散加權成像對肝癌放射治療療效評價的作用[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2015，12（11）：8-11.

[6] Chen H H，Cawood R，El-Sherbini Y，et al.Active adenoviral vascular penetration by targeted formation of heterocellular endothelial-epithelial syncytia[J].Mol Ther，2011，19（1）：67-75.

[7]李沖，王志平.溶瘤腺病毒抗腫瘤策略研究進展[J].基礎醫(yī)學與臨床，2016，36（4）：547-551.

[8]張新敏，張蓉，孟樹林，等.溶瘤腺病毒ZD55對類肝癌干細胞的抑制效應[J].生物化學與生物物理進展，2016，43（5）：496-505.

[9]中華醫(yī)學會中華放射學雜志編委會介入放射學組.肝癌介入治療規(guī)范化條例（草案）[J].中華放射學雜志，2001，35（12）：887-892.

[10] Kasuya H，Kodera Y，Nakao A，et al.Phase I dose-escalation clinical trial of HF10 oncolytic herpes virus in 17 Japanese patienrs with advanced cancer[J].Hepato-Gastroenterology，2014，61（131）：599-605.

[11]邱從坤，湯日杰，王忠富，等.三氧化二砷介入治療中晚期原發(fā)性肝癌的臨床療效研究[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新，2015，12（35）：35-38.

[12]牛堅，王月.下調(diào)CD133表達對肝癌干細胞上皮間質(zhì)化和侵襲能力影響及機制探討[J].中華腫瘤防治雜志，2016，23（11）：710-715.

[13] Conigliaro A，Costa V，Lo D A，et al.CD90+ livercancer cells modulate endothelial cell phenotype through the release of exosomes containing H19 lnc RNA[J].Mol Cancer，2015，14（1）：1-11.

[14] Yang X R，Xu Y，Yu B，et al.High expression levels of putative hepatic stem/progenitor cell biomarkers related to tumour angiogenesis and poor prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Gut，2010，59（7）：953-962.

[15] Hu C P，Wang A Q，Zhang H H，et al.Research progress and prospects of markers for liver cancer stem cells[J].World J Gastroenterol，2015，21（42）：12 190-12 196.

[16]王代宏，王芳元，王偉，等.原發(fā)性肝癌手術前后營養(yǎng)風險篩查及臨床分析[J].臨床外科雜志，2013，21（12）：933-936.

[17]王兵，丁佑銘，汪斌，等.原發(fā)性肝癌肝切除術前應用免疫營養(yǎng)支持對血液免疫有關指標的影響[J].中華臨床營養(yǎng)雜志，2013，21（2）：109-111.

[18]徐陽，臧爽，陳路鋒，等.Logistic回歸及ROC曲線綜合評價血生化指標對肝癌TACE術后發(fā)熱的預測價值[J].介入放射學雜志，2013，22（6）：513-517.

[19]臧爽，陳路鋒，牛猛，等.肝癌患者肝動脈化療栓塞術后血液指標對栓塞綜合征預測價值分析[J].中華腫瘤防治雜志，2015，22（8）：623-628.

[20]薛玉珠.早期腸內(nèi)營養(yǎng)對肝癌介入術后機體營養(yǎng)狀況及腸功能的影響[J].中國美容醫(yī)學，2012，21（12）：492-493.

（收稿日期：2017-04-25） （本文編輯：鄧朝陽）endprint