高楊　何則平　王銳　李艷麗　趙欣　張策

【摘要】 目的：觀察CFA致炎大鼠脊髓腰膨大組織內miRNA-133b-3p與P2X4受體表達的相關關系。方法：大鼠足底注射CFA后，0 h、2 h、1 d、3 d檢測大鼠機械痛和熱痛的痛閾值變化，且在這四個時間點取脊髓腰膨大組織，提取總RNA和蛋白質，檢測miRNA-133b-3p表達量的變化，同時檢測P2X4受體mRNA和蛋白的表達量的變化。結果：與對照組相比，大鼠腳掌注射CFA后，機械痛和熱痛痛閾均明顯下降（P<0.05），在2 h時痛閾最低，1 d和3 d時較2 h略有回升；腰膨大部位miRNA-133b-3p表達量在2 h時沒有變化，1 d和3 d開始呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢（P<0.05），四個時間點P2X4受體mRNA表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但P2X4受體蛋白在3 d時表達量顯著升高（P<0.05）。結論：CFA致炎大鼠脊髓腰膨大組織miRNA-133b-3p表達下調，同時P2X4受體表達上調，兩者可能存在負向調控關系。

【關鍵詞】 慢性痛； CFA； 腰膨大； miRNA-133b-3p； P2X4受體

Expression of MiRNA-133b-3p and P2X4R in Lumbar Spinal Cord of CFA-induced Inflammatory Pain Rats/GAO Yang，HE Ze-ping，WANG Rui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：025-028

【Abstract】 Objective： To observe the expression pattern of miRNA-133b-3p and P2X4R in lumbar spinal cord of complete Freunds adjuvant（CFA）-induced inflammatory pain rats.Method：CFA was intraplantar injected to the rats.Then we measured the threshold to mechanical stimuli and noxious thermal stimuli at 0 h，2 h，1 d and 3 d after CFA injection.After the behavior observation，the lumbar spinal cord were isolated from the rats，and the total RNA and protein were extracted for the detection of miRNA-133b-3p，P2X4R mRNA and P2X4R protein.Result：Compared with the control group，the threshold of rats to mechanical stimuli and noxious thermal stimuli decreased and peaked at 2 h after CFA injection（P<0.05），then recovered slightly at 1 and 3 d（P<0.05）.The expression of miRNA-133b-3p did not change at 2 h，and decreased gradually at 1 and 3 d after CFA injection（P<0.05）.P2X4R mRNA expression had no significantly change after CFA injection（P>0.05），but P2X4R protein increased significantly at 3 d after CFA injection（P<0.05）.Conclusion：The expression of miRNA-133b-3p is decreased in lumbar spinal cord of CFA-injected inflammatory pain rats，meanwhile，the expression of P2X4R protein is increased.There may be a negative relationship between miRNA-133b-3p and P2X4R.

【Key words】 Chronic pain； CFA； Lumbar spinal dorsal cord； MiRNA-133b-3p； P2X4R

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.007

國際疼痛學會（IASP）指出疼痛是組織損傷或潛在組織損傷所引起的不愉快感覺和情感體驗。慢性疼痛是目前嚴重影響人類生存質量的一種疾病，現(xiàn)有鎮(zhèn)痛治療常療效欠佳且伴發(fā)一系列的副作用，慢性疼痛的發(fā)病機制仍需深入研究。脊髓敏感化是慢性疼痛形成的重要成因之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)慢性疼痛發(fā)生時脊髓組織內很多蛋白表達水平發(fā)生了改變，包括神經遞質、細胞因子等[2-5]。尋找這些蛋白表達的調控機制將可能為慢性疼痛的治療提供更多證據(jù)。

microRNA（miRNA）是由20～23個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA。在生物體內miRNA可以與一個或者多個mRNA的3UTR區(qū)互補，降解或抑制靶基因mRNA，從而抑制靶基因的表達[6]。

筆者采用高通量的miRNA array方法篩選了CFA炎性痛模型大鼠背根神經節(jié)（DRG）組織內的差異表達miRNA，結果發(fā)現(xiàn)miRNA-133b-3p在CFA大鼠DRG組織中表達下調。用生物信息學軟件分析靶標基因，發(fā)現(xiàn)miRNA-133b-3p存在與P2X4受體基因的3'UTR區(qū)相匹配的區(qū)域。因此miRNA-133b-3p是P2X4受體基因表達的可能調節(jié)者之一。endprint

P2X4受體是P2X受體七種亞型之一。ATP激活受體后引起陽離子（Na+、K+、Ca2+）非選擇性內向整流。研究發(fā)現(xiàn)P2X4受體參與脊髓小膠質細胞的活化，在脊髓敏感化及慢性疼痛中發(fā)揮重要的作用。

基于以上結果，筆者以腳掌注射CFA的SD大鼠為慢性炎性痛模型，在體觀察大鼠脊髓腰膨大miRNA-133b-3p和P2X4受體在CFA注射后不同時間段的表達情況，明確miRNA-133b-3p和P2X4受體表達的相關關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 200～250 g的SPF級大鼠，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。大鼠飼養(yǎng)于22 ℃的恒溫環(huán)境中，保持12 h照明/黑暗的晝夜節(jié)律，自由進食和飲水。動物實驗過程符合實驗動物管理條例。

1.2 動物分組與模型制備 48只大鼠隨機分為對照組（n=24）與實驗組（n=24）。對照組動物腳掌注射生理鹽水100 μL，實驗組動物腳掌注射CFA 100 μL（F5881，Sigma）。

1.3 機械痛測定（Von Fery Test） 機械痛測定使用的是50%縮足閾（Fifty percent paw withdrawal threshold）的方法[7]，測量時用1、1.4、2、4、6、8、10、15 g八根Von Fery針，從4 g開始在，如果大鼠抬腳，記為“X”，則依次增大克數(shù)測試；如果大鼠不抬腳，記為“O”，依次減少克數(shù)測試。6次有效反應從第一次不同于前一次反應的前一次反應開始。大鼠一直沒有反應至15 g或1 g，痛閾記為15 g和1 g。

1.4 熱痛測定（Von Fery Test） 檢測時室溫維持在20～25 ℃，大鼠環(huán)境適應30 min。熱輻射光源（8 V，50 W）照射大鼠注射側腳掌，記錄光源打開至大鼠縮足的間隔時間， 20 s后熱輻射停止。每只大鼠測量3次，間隔時間為5 min，取平均值。

1.5 總RNA提取 大鼠麻醉取出左側脊髓腰膨大，液氮速凍；用miRNeasy Mini Kit（217004，Qiagen）按照操作說明提取總RNA；測量RNA濃度，-80 ℃冰箱保存。

1.6 microRNA熒光定量PCR 根據(jù)操作說明采用microRNA反轉錄試劑為miScript Ⅱ RT Kit（Qiagen）進行反轉錄。采用The miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen）對cDNA進行熒光定量。引物由Invritrogen和Qiagen公司設計合成。

1.7 mRNA熒光定量PCR 采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TARAKA）進行mRNA反轉錄。利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TAKARA），進行熒光定量。引物由Invritrogen公司設計合成。

1.8 Western Blotting 將大鼠麻醉取出左側脊髓腰膨大，液氮速凍；組織超聲破碎后測定蛋白質濃度；40 μg/孔上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉；P2X4一抗（13534-1-AP，Proteintech，1∶500）孵育；山羊抗兔二抗孵育1 h；ECL超敏化學發(fā)光，GChemiDoc MP成像系統(tǒng)成像，Imaging labTM軟件分析。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用（x±s）表示，自身處理前后采用獨立樣本t檢驗，多組樣本間均數(shù)比較用One-way ANOVA方差檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 炎性痛模型的制備 在CFA注射后0 h、2 h、1 d、3 d四個時間點檢測了大鼠的機械痛和熱痛痛閾的變化。

2.1.1 機械痛測量 50%痛閾結果顯示（圖1），實驗組和對照組大鼠的基礎痛閾比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。CFA注射后2 h、1 d、3 d，實驗組大鼠痛閾明顯減低，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.1.2 熱痛測量 熱痛痛閾結果顯示（圖1），0 h時兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），2 h、1 d、3 d 時兩組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 P2X4受體基因mRNA的表達量 qPCR檢測腰膨大P2X4受體基因的表達量，actin為內參（圖2）。與對照組相比，實驗組注射CFA后P2X4受體基因mRNA的表達量2 h、1 d、3 d相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 P2X4受體蛋白的表達量 Western Blot檢測P2X4受體蛋白的表達量，GAPDH為內參蛋白（圖3）。結果顯示，2 h和1 d 兩組比較，P2X4受體蛋白表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），3 d時CFA組P2X4受體蛋白表達量顯著上升（P<0.05）。

2.4 microRNA-133b-3p的表達量 qPCR檢測腰膨大miRNA-133b-3p的表達量，U6為內參（圖4）。與對照組相比，實驗組miRNA-133b-3p的表達量在CFA注射后2 h時沒有改變（P>0.05），1 d和3 d時表達量均顯著下降（P<0.05）。

3 討論

痛覺的產生是由感覺神經末梢感受到傷害性刺激，經由感覺神經纖維傳導至脊髓背角，之后上傳到丘腦，進而投射到大腦皮質，最終產生痛覺。炎性痛為生活中最常見的疼痛之一，表現(xiàn)為痛覺過敏、痛覺異常和觸誘發(fā)痛。炎性痛的形成機制很復雜，包括發(fā)生在外周組織的敏化以及中樞敏化，而脊髓水平的敏化與神經膠質細胞活化密切相關[8]。

圖4 注射CFA后腰膨大miRNA-133b-3p的表達情況endprint

大鼠左側腳掌注射生理鹽水，沒有出現(xiàn)炎性反應，且行動正常。大鼠左側后腳掌注射CFA后，患側腳掌出現(xiàn)紅、腫等炎性反應，運動時患側腳掌離地，輕抬腳掌，經常舔舐患側腳掌。痛行為可以看出2 h后實驗組痛閾顯著下降，并且在3 d內痛閾維持在較低的水平。以上說明CFA炎性痛大鼠模型制備成功。

在炎性痛痛覺上傳的過程中傷害性的刺激激活或調節(jié)脊髓背角許多基因的表達，如c-fos[9]、Cox-2[10]和nNOS[11]等，同時會激活脊髓背角神經膠質細胞[12]。當炎癥發(fā)生時，脊髓中小膠質細胞對細胞外環(huán)境敏感，最先被激活[13]，膜表面受體上調。炎癥或神經損傷后組織內液ATP及其代謝產物增多[14-16]，可以作用于小膠質細胞P2X4和P2X7等受體形成疼痛[17-18]。P2X4受體是小膠質細胞激活的必要條件[19]。在神經病理痛時，患側脊髓背腳小膠質細胞高表達P2X4受體。鞘內注射P2X4受體激活的小膠質細胞可以誘發(fā)小鼠痛敏，且阻斷P2X4受體后痛敏明顯緩解[20]。脊髓損傷模型中P2X4-/-小鼠痛敏閾值明顯高于正常對照小鼠[21]。外周神經損傷模型大鼠脊髓小膠質細胞被激活，激活的小膠質細胞P2X4受體上調且釋放BDNF，參與神經病理痛的形成[22]。在腦脊髓炎時，大鼠脊髓背腳中P2X4受體表達上調，且與小膠質細胞共定位[23]。尾靜脈注射P2X4受體反義鏈可以抑制NLRP1炎癥信號通路減輕大鼠膠原導致的關節(jié)炎癥狀[24]。腳掌注射CFA炎性痛模型中P2X4-/-小鼠痛敏閾值明顯高于正常對照小鼠[25]。

在CFA大鼠腳掌注射前和注射后2 h、1 d、3 d四個時間點取大鼠脊髓腰膨大，檢測P2X4受體基因mRNA和蛋白的表達量及miRNA-133b-3p的表達量。結果發(fā)現(xiàn)，在CFA注射前后，P2X4受體mRNA表達量均無差別，但P2X4受體蛋白表達呈上升趨勢，且在3 d時蛋白表達顯著增加。

microRNA作為一種轉錄后調節(jié)基因翻譯的非編碼RNA，與一個或多個靶基因3UTR區(qū)結合，抑制mRNA翻譯[25]。miRNA-133b-3p在CFA注射后1 d時開始顯著下調，且3 d時表達較1 d時更低。實驗現(xiàn)象觀察得出，炎癥發(fā)生時脊髓腰膨大部位miRNA-133b-3p的表達量下降，P2X4受體mRNA表達量沒有改變，但P2X4受體蛋白的表達增高。

本實驗證實脊髓腰膨大組織內miRNA-133b-3p與靶基因P2X4受體表達之間存在負向關系。結果提示，CFA致炎性痛模型脊髓背角miRNA-133b-3p表達減少，抑制P2X4受體表達的作用減弱，導致P2X4受體表達上調，促進了小膠質細胞的活化，繼而產生疼痛。

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（收稿日期：2017-05-02） （本文編輯：程旭然）endprint