葉菁菁

【摘要】 目的：探討甘草酸對膿毒癥小鼠模型的腎臟保護(hù)作用。方法：選取150只小鼠隨機(jī)分為5組：手術(shù)+安慰劑組，手術(shù)+高劑量藥物組，手術(shù)+中劑量藥物組，手術(shù)+低劑量藥物組，假手術(shù)+安慰劑組，每組各30只。干預(yù)4 h后使用半定量方式比較各組小鼠腎臟組織病理切片中腎小管損傷情況。結(jié)果：各組評分手術(shù)+安慰劑組>手術(shù)+低劑量藥物組>手術(shù)+中劑量藥物組>手術(shù)+高劑量藥物組>假手術(shù)+安慰劑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：甘草酸能在一定程度上減輕膿毒癥小鼠的腎損害。

【關(guān)鍵詞】 膿毒癥； 急性腎損傷； 甘草酸

【Abstract】 Objective：To investigate the renal protective effect of glycyrrhizin on sepsis in mice.Method：150 mice were randomly divided into 5 groups：operation+placebo group，operation+high dose group；operation+medium dose group，operation+low dose group，sham operation+placebo group，30 cases in each group.After the intervention 4 h，the injury of renal tubules in pathological sections of mice in each group was compared by semi quantitative method.Result：All groups scored：sepsis+placebo group>sepsis+low dose group>sepsis+medium dose group>sepsis+high dose group>sham operation+placebo group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Glycyrrhizin can alleviate renal damage in sepsis mice to some extent.

【Key words】 Sepsis； Acute kidney injury； Glycyrrhizic Acid

First-authors address：The First Affiliated Hospital Fuzhou City of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.004

甘草酸（Glycyrrhizic Acid，GA）是從傳統(tǒng)中藥甘草根部提取出來的主要活性成分，是一種三萜類化合物。甘草酸除了長期以來被使用在糖果生產(chǎn)和化妝品生產(chǎn)工業(yè)上之外，還是一種使用范圍極廣的中藥[1]。甘草酸體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對T淋巴細(xì)胞活化具有調(diào)節(jié)作用，對γ干擾素有誘導(dǎo)作用，活化NK細(xì)胞，促進(jìn)胸腺外T淋巴細(xì)胞分化。目前臨床多是應(yīng)用于慢性肝病、改善肝功能異常，治療濕疹、皮膚炎、蕁麻疹等疾病。本實(shí)驗(yàn)以盲腸結(jié)扎穿刺法造膿毒癥小鼠模型，觀察復(fù)方甘草酸苷注射液對膿毒癥小鼠腎臟的保護(hù)作用，為甘草酸的臨床適應(yīng)證范圍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)條件 清潔級8周齡BALB/C雄性小鼠150只，體重（21±1）g，雄性，由福建醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。動物實(shí)驗(yàn)室溫度23 ℃，相對濕度40%～60%，白/夜循環(huán)為12/12 h。

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 復(fù)方甘草酸苷注射液（日本米諾發(fā)源制藥株式會社座間工廠生產(chǎn)廠家，國藥準(zhǔn)字J20130071）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組、模型制備及給藥 雄性BALB/C小鼠150只，隨機(jī)分為5組，手術(shù)組+安慰劑組、手術(shù)組+高劑量藥物組、手術(shù)組+中劑量藥物組、手術(shù)組+低劑量藥物組、假手術(shù)組+安慰劑組，每組30只。手術(shù)組采用盲腸結(jié)扎穿刺法造模，假手術(shù)組同樣開腹，但是盲腸不結(jié)扎不穿刺納回腹腔再縫合腹壁。將藥品說明書中動物實(shí)驗(yàn)提供的半數(shù)致死量作為參考數(shù)據(jù)，選取半數(shù)致死量的1/8、1/16、1/32分別為高劑量、中劑量、低劑量。造模后立即給予腹腔注射等體積的復(fù)方甘草酸苷注射液或生理鹽水進(jìn)行干預(yù)，手術(shù)組+安慰劑組（生理鹽水），手術(shù)組+高劑量藥物組（25.9 mL/kg），手術(shù)組+中劑量藥物組（12.95 mL/kg），手術(shù)組+低劑量藥物組（6.475 mL/kg），假手術(shù)+安慰劑組（生理鹽水）。術(shù)后4 h，頸椎脫臼法處死小鼠。剝離完整腎臟組織，置于10%福爾馬林溶液中固定48 h。

1.2.2 觀察小鼠一般狀態(tài) 術(shù)后觀察小鼠精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)、飲食情況等，并記錄。

1.2.3 腎臟組織病理學(xué)觀察 10%福爾馬林固定的腎臟組織制備石蠟切片，每只大鼠制備3張切片，HE染色，光鏡下觀察腎臟組織腎小管上皮細(xì)胞的病理改變。

1.3 評分標(biāo)準(zhǔn) 混濁、腫脹、壞死的腎小管上皮細(xì)胞為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞百分比：在光鏡下（×400）10個視野計(jì)數(shù)，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞的陽性細(xì)胞平均數(shù)。評分標(biāo)準(zhǔn)為：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞百分比≤25%為1分，陽性細(xì)胞百分比26%～50%為2分，陽性細(xì)胞百分比51%～75%為3分，陽性細(xì)胞百分比≥76%為4分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，兩兩比較用秩變換后進(jìn)行方差分析，計(jì)數(shù)資料采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)觀察結(jié)果 假手術(shù)+安慰劑組小鼠手術(shù)麻醉復(fù)蘇后，精神狀態(tài)如常，正常進(jìn)食進(jìn)水。手術(shù)組的小鼠麻醉復(fù)蘇后，出現(xiàn)精神萎靡、立毛、懶動，不喜進(jìn)食進(jìn)水。

2.2 病理組織學(xué)光鏡下觀察結(jié)果 肉眼觀察假手術(shù)組小鼠腎臟組織表面光滑，呈現(xiàn)鮮紅色，質(zhì)地柔軟。手術(shù)組小鼠腎臟組織較假手術(shù)組稍大，顏色稍蒼白、暗淡。光鏡下觀察，無論是否進(jìn)行了盲腸結(jié)扎穿刺的小鼠，腎小管上皮細(xì)胞均出現(xiàn)了不同程度的腫脹、壞死，見圖1。手術(shù)組小鼠的腎臟組織中，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的混濁、腫脹、壞死，見圖2。經(jīng)過復(fù)方甘草酸苷注射液干預(yù)的手術(shù)組小鼠腎小管上皮細(xì)胞的病變范圍有所減輕，見圖3。

2.3 病理組織結(jié)果 兩兩比較顯示評分手術(shù)+安慰劑組>手術(shù)+低劑量藥物組>手術(shù)+中劑量藥物組>手術(shù)+高劑量藥物組>假手術(shù)+安慰劑藥物組，不同組間的評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。其中4分檔次組中以手術(shù)+安慰劑組樣本數(shù)最多，其次為手術(shù)+低劑量藥組；3分檔次組中手術(shù)+高劑量藥組樣本數(shù)最多，其次為手術(shù)+中劑量組；在2分檔次組中手術(shù)+高劑量藥組樣本數(shù)最多，其次是手術(shù)+高劑量藥組；1分檔次組中只有假手術(shù)+安慰劑組樣本，見圖4。值得注意的是，在2分及1分檔次組中均缺如手術(shù)+安慰劑組的樣本。并且1分檔次組中均無手術(shù)組的樣本。與之相對應(yīng)的是，假手術(shù)+安慰劑組的樣本在4分及3分檔次組中也出現(xiàn)了缺如，見圖5。

3 討論

膿毒癥（sepsis）是一個古老的醫(yī)學(xué)話題，關(guān)于膿毒癥的治療更是一個古老的課題。隨著全球人口老齡化的不斷進(jìn)展，腫瘤發(fā)病率年年攀升；醫(yī)學(xué)進(jìn)步后帶來侵入性醫(yī)療操作的增加，使得膿毒癥發(fā)病率逐年攀升[2]。目前膿毒癥3.0將膿毒癥定義為宿主對感染的反應(yīng)性失調(diào)，產(chǎn)生危及生命的器官功能損害[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，膿毒血癥的病死率與感染病原體的相關(guān)性不大，但與患者的炎癥反應(yīng)具有重要的相關(guān)性[4]。在膿毒癥導(dǎo)致的器官功能損害中，首當(dāng)其沖的臟器就是腎臟。有學(xué)者對歐美多個ICU的重癥患者進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，膿毒癥導(dǎo)致急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）的發(fā)病率超過50%，且合并了AKI的膿毒癥患者死亡率明顯高于未合并AKI的膿毒癥患者，高達(dá)30%～60%。故目前將膿毒癥是否合并AKI看做是膿毒癥患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5-6]。隨著對膿毒癥致AKI發(fā)病機(jī)制的深入研究，目前認(rèn)為膿毒癥致AKI發(fā)生受多因素影響，包括炎性瀑布樣反應(yīng)直接損傷[7]，腎內(nèi)皮細(xì)胞損傷，微血栓形成[8-9]，腎臟血流動力學(xué)的改變[10]，免疫功能障礙[11]，腎臟細(xì)胞凋亡等。膿毒癥致AKI是一個連續(xù)性的發(fā)病過程，在早期以腎血流再分布異常導(dǎo)致的相對灌注不足以及能量代謝利用障礙為主，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、代謝障礙；其后以腎臟炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡為主要表現(xiàn)，提示腎臟細(xì)胞凋亡可能在膿毒癥致AKI中起著關(guān)鍵性作用[12]。AKI炎癥理論認(rèn)為含毒素血液的超濾是腎小管應(yīng)激繼而損害的引發(fā)機(jī)制[13]；膿毒癥時血中富含的中小分子物質(zhì)（細(xì)胞因子、趨化因子、補(bǔ)體片段、其他類似物）在超濾液中濃聚并作用于腎小管腔表面對腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。而機(jī)體免疫系統(tǒng)在致病微生物作用下會釋放出眾多的細(xì)胞因子，包括早期炎癥因子IL-1β、TNF-α等，以及一些晚期炎癥因子，如高遷移率族蛋白B1等。尤其是晚期炎癥因子，這些炎癥因子的產(chǎn)生明顯晚于早期炎癥因子，但是持續(xù)時間較長，并可通過多種途徑形成正反饋調(diào)節(jié)，將炎癥因子的產(chǎn)生釋放級聯(lián)放大，導(dǎo)致全身過度炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成臟器損傷[14]。

甘草酸是從甘草根部提取出來的有效活性成分，國內(nèi)外許多學(xué)者對其免疫作用進(jìn)行過研究。主要有效成分具有抗缺氧、抗局部缺血及抗炎等藥理作用，目前多用于肝病治療[15]，張偉等[16]研究發(fā)現(xiàn)甘草酸二銨對百草枯中毒大鼠具有腎臟保護(hù)作用。有學(xué)者使用RAW264.7細(xì)胞（BALB/c小鼠的巨噬細(xì)胞）研究甘草酸的抗炎作用機(jī)制，證明了甘草酸是通過PI3K/Akt/GSK3β途徑減少LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IL-1和TNF炎癥基因表達(dá)，進(jìn)而使得IL-1β和TNF-α濃度下降。國外還有文獻(xiàn)報(bào)道甘草酸是HMGB1的功能性抑制劑，它可以直接和HMGB1結(jié)合，阻斷HMGB1和蛋白激酶C之間的相互作用，抑制HMGB1的磷酸化。HMGB1磷酸化是HMGB1分泌的第一步，能阻止HMGB1從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，阻斷HMGB1和炎癥因子的正反饋[17]。本實(shí)驗(yàn)中手術(shù)+甘草酸治療組的膿毒癥小鼠腎臟病理切片中腎臟的損傷程度較手術(shù)+安慰劑組膿毒癥小鼠腎臟損傷的程度輕，且呈明顯的劑量依耐性。甘草酸能夠通過PI3K/Akt/GSK3β途徑[18]和HMGB1/HMGB1受體（TLR4和RAGE）/NF-κB信號通路減少早期和晚期炎癥因子的分泌，打斷炎癥因子的正反饋，調(diào)節(jié)膿毒癥相關(guān)過度炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對腎臟的保護(hù)作用[19]。臨床國內(nèi)學(xué)者張瓊?cè)A等[20]也觀察到甘草酸二銨注射液能夠降低膿毒癥AKI患者血清TLR4水平，并改善患者腎功能。

在本實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)無論是否接受了盲腸結(jié)扎穿刺手術(shù)，只要是接受了麻醉和腹部切開應(yīng)激的小鼠，腎臟均出現(xiàn)了不同程度的急性腎損傷的病理表現(xiàn)。其中4分檔次組中以手術(shù)+安慰劑組樣本數(shù)最多，其次為手術(shù)+低劑量藥組；3分檔次組中手術(shù)+高劑量藥組樣本數(shù)最多，其次為手術(shù)+中劑量組；在2分檔次組中手術(shù)+高劑量藥組樣本數(shù)最多，其次是手術(shù)+高劑量藥組；1分檔次組中只有假手術(shù)+安慰劑組樣本。在2分及1分檔次組中均缺如手術(shù)+安慰劑組的樣本，并且1分檔次組中均無手術(shù)組的樣本。與之相對應(yīng)的是，假手術(shù)+安慰劑組的樣本在4分及3分檔次組中也出現(xiàn)了缺如。其中假手術(shù)組的小鼠腎臟組織中腎小管損傷的程度較為輕微，考慮其損傷與麻醉、手術(shù)應(yīng)激引起的無菌性炎癥有關(guān)。而施行了盲腸結(jié)扎穿刺手術(shù)的小鼠，無論是否接受干預(yù)治療，腎臟的細(xì)胞水腫均較為嚴(yán)重。尤其是手術(shù)后僅使用了安慰劑的小鼠，評分為4～3分，4分比例也是最多的。手術(shù)后使用藥物干預(yù)的小鼠，腎臟得到了有效的保護(hù)，評分較手術(shù)+安慰劑組明顯降低，但該實(shí)驗(yàn)中并未觀察到腎小管壞死現(xiàn)象，這可能與觀察時間為膿毒血癥早期有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘草酸可減輕對膿毒癥小鼠發(fā)生AKI的程度，尤其是在高劑量組，提示其可在早期膿毒癥腎臟保護(hù)方面發(fā)揮作用，且呈明顯的劑量依賴性，但其具體機(jī)制及其臨床實(shí)用劑量需進(jìn)一步的研究。endprint

參考文獻(xiàn)

[1] Ming L J，Yin A C.Therapeutic effects of glycyrrhizic acid[J].Nat Prod Commun，2013，8（3）：415-418.

[2] Fleischmann C.Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis.Current Estimates and Limitations[J].Am J Respir Crit Care Med，2016，193（3）：259-272.

[3] Singer M.The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock （Sepsis-3）[J].JAMA，2016，315（8）：801-810.

[4] Yadav H，Cartinceba R.Balance between hyperinflammation and immunosuppression in sepais[J].Semin Reapir Crie Care Med，2016，37（1）：42-50.

[5] Anderberg S B，Luther T，F(xiàn)rithiof R. Physiological aspects of Toll-like receptor 4 activation in sepsis-induced acute kidney injury[J].Acta Physiol （Oxf），2017，219（3）：573-588.

[6] Veldt B J.Long-term clinical outcome and effect of glycyrrhizin in 1093 chronic hepatitis C patients with non-response or relapse to interferon[J].Scand J Gastroenterol，2006，41（9）：1087-1094.

[7] Gomez H，Ince C，De Backer D，et al. unified theory of sepsis-induced acute kidney injury：Inflammation，microcirculatory dysfunction，bioenergetics，and the tubular cell adaptation to injury[J].Shock，2014，4（1）：3-11.

[8] Engelmann B，Massberg S.Thrombosis as an intravascular effector of innate immunity[J].Nat Rev Immunol，2013，13（1）：34-45.

[9] Meier J，Henes J，Rosenberger P. Bleeding and coagulopathies in critical care[J].N Engl J Med，2014，370（22）：2152-2153.

[10] Prowle J，Bellomo R.Sepsis-associated acute kidney injury：Macrohemodynamic and microhemodynamic alterations in the renal circulation[J].Semin Nephrol，2015，35（1）：64-74.

[11] Kockara A，Kayatas M.Renal cell apoptosis and new treatment options in sepsis -induced Acute Kidney Injury[J].Renal Failure，2013，35（2）：291-294.

[12] Suh S H，Lee K E，Kim I J，et al.Alpha-lipoic acid attenuates lipopolysaccharide-induced kidney injury[J].Clin Exp Nephrol，2015，19（1）：82-91.

[13] Shum H P，Yan W W，Chan T M.Recent knowledge on the pathophysiology of septic acute kidney injury： A narrative review[J].J Crit Care，2016，31（1）：82-89.

[14] Angus D C，Van P T.Severe sepsis and septic shock[J].N Engl J Med，2013，369（9）：840-851.

[15]劉梅梅，王齊，劉曉利，等.甘草酸二銨脂質(zhì)配體對非酒精性脂肪肝大鼠白細(xì)胞浸潤的影響[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2013，22（5）：426-431.

[16]張偉，張劍鋒，李浩，等.甘草酸二銨對百草枯中毒大鼠腎臟組織TOL樣受體4表達(dá)的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2015，24（11）：1214-1219.

[17] Lau A，Wang S，Liu W，et al.Glycyrrhizic acid ameliorates HMGB1-mediated cell death and inflammation after renal ischemia reperfusion injury[J].Am J Nephrol，2014，40（1）：84-95.

[18] Zhao H，Zhao M，Wang Y，et al.Glycyrrhizic Acid Attenuates Sepsis-Induced Acute Kidney Injury by Inhibiting NF-kappaB Signaling Pathway[J].Evid Based Complement Alternat Med，2016，24（1）：1-11.

[19] Doi K.Role of kidney injury in sepsis[J].J Intensive Care，2016，17（4）：1-6.

[20]張瓊?cè)A，田耕.甘草酸二銨注射液對膿毒癥AKI患者血清TLR4水平的影響及臨床意義[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2017，34（4）：789-792.

（收稿日期：2017-07-14） （本文編輯：周亞杰）endprint